長(zhǎng)非編碼RNA TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控及其在血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本論文旨在研究lncRNA TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)功能，以生物活性的化學(xué)小分子為工具，研究TGFB2-OT1在內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥中的表達(dá)調(diào)控及其作用機(jī)制，鑒定出參與此過(guò)程的新的關(guān)鍵因子和信號(hào)通路，為治療心血管疾病提供新的靶點(diǎn)和有效工具。
　　1.研究NUPR1和TIA1對(duì)TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制。
　　2.研究TIA1與ANXA7的相互作用及其調(diào)控TGFB2-OT1表達(dá)的機(jī)制。<

2、br>　　3.研究TGFB2-OT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中的作用。
　　4.研究TGFB2-OT1調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.本論文是以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）為細(xì)胞模型，以apoE/-小鼠為動(dòng)物模型，以化學(xué)小分子ABO和3BDO為工具，進(jìn)行相關(guān)研究。
　　2.檢測(cè)NUPR1和TIA1對(duì)TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控:
　　2.1

3、利用原位雜交和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，有無(wú)3BDO存在時(shí)，LPS對(duì)TGFB2-OT1表達(dá)水平的影響。
　　2.2 利用Western blot檢測(cè)LPS對(duì)TIA1蛋白水平的影響，以及oxLDL對(duì)NUPR1和TIA1蛋白水平的影響。
　　2.3 利用RNA干擾技術(shù)，Westem blot以及熒光定量PCR方法檢測(cè)NUPR1和TIA1在調(diào)控TGFB2-OT1表達(dá)中的上下游關(guān)系。
　　3.檢測(cè)ANXA7和TI

4、A1的相互作用及其調(diào)控方式:
　　3.1 以時(shí)間依賴的方式用ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，提取蛋白，利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)ABO對(duì)TIA1和ANXA7相互作用的影響。
　　3.2 以時(shí)間依賴的方式用ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，以TIA1siRNA處理組來(lái)確定磷酸化條帶的特異性，免疫沉淀檢測(cè)ABO對(duì)TIA1磷酸化水平的影響。
　　3.3 用ANXA7siRNA下調(diào)ANXA7的表達(dá)后，再用ABO處理，免疫沉淀檢測(cè)ANXA7對(duì)TIA1

5、磷酸化水平的影響。
　　4.檢測(cè)ANXA7和TIA1對(duì)TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控:
　　4.1 利用半定量PCR技術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ABO處理對(duì)TGFB2-OT1水平的影響。
　　4.2 利用Western blot檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ABO處理對(duì)ATG13蛋白水平的影響。
　　4.3 利用RNA干擾技術(shù)，Western blot以及免疫熒光檢測(cè)下調(diào)TIA1的表達(dá)后，ABO誘導(dǎo)的自噬水平變化。
　　4.4

6、在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，用3BDO和ABO共同處理，利用Western blot和免疫熒光檢測(cè)LC3-Ⅱ的蛋白水平和在細(xì)胞中的分布，以明確自噬水平的變化。
　　5.ANXA7和TIA1作用機(jī)制的體內(nèi)驗(yàn)證:
　　5.1 用高脂飼料喂養(yǎng)apoE-/-小鼠，建立動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型，腹腔注射ABO（50mg/kg/day）和等劑量的DMSO。
　　5.2 取胸主動(dòng)脈，進(jìn)行冰凍組織切片，以CD31作為內(nèi)皮層的標(biāo)記，利用免疫熒光雙染色

7、的方法檢測(cè)內(nèi)皮層上ANXA7和TIA1相互作用的變化。
　　5.3 在冰凍組織切片上，以CD31作為內(nèi)皮層的標(biāo)記，利用免疫熒光染色的方法檢測(cè)內(nèi)皮層上ATG13的水平變化。
　　6.能夠與TGFB2-OT1結(jié)合的新的microRNA的鑒定:
　　6.1 利用microRNA芯片尋找受到TGFB2-OT1調(diào)控的microRNA。
　　6.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)能夠與TGFB2-OT1結(jié)合的microRNA。
　　6

8、.3 結(jié)合microRNA芯片和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果，選擇合適的microRNA，利用熒光定量PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　6.4 構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，將TGFB2-OT1野生型cDNA以及分別突變與MIR3960和MIR4488結(jié)合位點(diǎn)的TGFB2-OT1突變型cDNA克隆到熒光素酶報(bào)告基因下。將野生型以及突變型熒光素酶報(bào)告基因載體分別與MIR3960和MIR4488mimics共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。利用雙熒光素酶活性檢測(cè)

9、試劑盒檢測(cè)熒光素酶的活性，證明MIR3960和MIR4488能夠與TGFB2-OT1直接結(jié)合。
　　7.MIR3960和MIR4488靶點(diǎn)的驗(yàn)證:
　　7.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MIR3960和MIR4488的靶基因。
　　7.2 利用MIR3960和MIR4488的mimics和inhibitor，研究其對(duì)靶基因mRNA和蛋白水平的影響。
　　7.3 將CERS1和NAT8L的3'UTR分別克隆到熒光素酶報(bào)告基因下

10、，與MIR3960和MIR4488mimics分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。利用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的活性，驗(yàn)證MIR3960和MIR4488與靶基因CERS1和NAT8L的直接結(jié)合。
　　7.4 利用Western blot和過(guò)表達(dá)技術(shù)，檢測(cè)TGFB2-OT1對(duì)靶基因CERS1和NAT8L的影響。
　　8.MIR4459的靶基因LARP1在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的作用檢測(cè):
　　8.1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，利用MI

11、R4459mimics轉(zhuǎn)染檢測(cè)LAPR1水平的變化。
　　8.2 利用Western blot和過(guò)表達(dá)技術(shù)，檢測(cè)TGFB2-OT1對(duì)LAPR1水平的影響。
　　8.3 檢測(cè)MIR4459mimics轉(zhuǎn)染對(duì)SQSTM1水平的影響。
　　8.4 利用過(guò)表達(dá)技術(shù)，Western blot以及熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TGFB2-OT1對(duì)SQSTM1下游因子半胱氨酸蛋白酶1(Caspase1)切割及白介素1β(IL1B)水平的影響

12、。
　　9.陰性對(duì)照載體lncRNA AF007131在炎癥反應(yīng)中作用的檢測(cè):
　　9.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，利用過(guò)表達(dá)技術(shù)，Western blot以及免疫熒光方法檢測(cè)AF007131對(duì)SQSTM1水平和分布的影響。
　　9.2利用過(guò)表達(dá)技術(shù)和免疫熒光方法檢測(cè)AF007131對(duì)NFKB RELA亞基在血管內(nèi)皮細(xì)胞中分布情況的影響。
　　結(jié)果：
　　1.NUPR1通過(guò)促進(jìn)TIA1的蛋白水平上調(diào)TGFB2-OT

13、1的表達(dá)。
　　1.1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，原位雜交以及熒光定量PCR結(jié)果顯示，LPS處理以時(shí)間和劑量依賴的方式上調(diào)TGFB2-OT1的水平，而用3BDO同時(shí)處理時(shí)，會(huì)抑制TGFB2-OT1水平的上調(diào)。
　　1.2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，LPS和oxLDL的處理均會(huì)上調(diào)NUPR1和TIA1的蛋白水平，而3BDO會(huì)抑制NUPR1和TIA1蛋白水平的上調(diào)。
　　1.3 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，干擾掉NUPR1或TIA1的表達(dá)后，LPS

14、就不能誘導(dǎo)TGFB2-OT1水平的上調(diào)。
　　1.4 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，干擾掉NUPR1的表達(dá)后，LPS就不能引起TIA1蛋白水平的上調(diào)。
　　2.ABO促進(jìn)TIA1和ANXA7的相互作用，抑制TIA1的磷酸化。
　　2.1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，用ABO處理2h和3h會(huì)明顯促進(jìn)ANXA7和TIA1的相互作用。
　　2.2 ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞3h，會(huì)明顯抑制TIA1絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平，干擾掉ANXA7的表達(dá)后

15、，ABO對(duì)TIA1磷酸化水平的影響被抑制。
　　2.3 在干擾掉TIA1的表達(dá)后，ABO就不能上調(diào)LC3-Ⅱ的蛋白水平及其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的點(diǎn)狀聚集，也不能下調(diào)SQSTM1的水平，表明TIA1通過(guò)與ANXA7相互作用參與到ABO誘導(dǎo)的自噬過(guò)程中。
　　3.ANXA7和TIA1的相互作用促進(jìn)TGFB2-OT1的產(chǎn)生。
　　3.1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ABO處理12h和24h會(huì)上調(diào)TGFB2-OT1和ATG13的水平。

16、>　　3.2 用3BDO和ABO共同處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，會(huì)明顯抑制ABO誘導(dǎo)的LC3-I蛋白水平的上調(diào)以及在細(xì)胞中的點(diǎn)狀聚集。
　　4.在apoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層上，ABO能夠上調(diào)ANXA7和TIA1的相互作用，促進(jìn)ATG13的表達(dá)。
　　4.1 利用免疫熒光雙染方法，發(fā)現(xiàn)ABO處理明顯上調(diào)ANXA7和TIA1在主動(dòng)脈內(nèi)皮層上的共定位。
　　4.2 ABO處理組，小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層上ATG13的蛋白水平也有明顯提高。

17、
　　結(jié)論：
　　1.在炎性誘導(dǎo)因子LPS和oxLDL的作用下，NUPR1通過(guò)上調(diào)TIA1的蛋白水平來(lái)促進(jìn)TGFB2-OT1的產(chǎn)生，表明NUPR1和TIA1參與調(diào)控TGFB2-OT1的表達(dá)。
　　2.ANXA7通過(guò)與TIA1的相互作用，抑制TIA1的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)TGFB2-OT1的表達(dá)，表明ANXA7通過(guò)調(diào)控TIA1的磷酸化，與TIA1共同參與TGFB2-OT1表達(dá)調(diào)控。
　　3.TGFB2-OT1作為競(jìng)爭(zhēng)性