MicroRNA-30b影響大鼠RGCs極性的機制及在糖氧剝奪損傷中的保護作用.pdf

1、目的:視神經損傷是臨床治療的難點，探討其損傷后修復相關問題對于視功能恢復和中樞神經疾病的治療都有非常重要的意義。以往研究聚焦于視網膜神經節(jié)細胞軸突再生，并以此來提高損傷修復，但未取得滿意結果。近年來研究發(fā)現促進視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)軸突生長的同時，出現了再生纖維投射紊亂，妨礙視覺功能恢復的新問題。有研究認為神經元極性紊亂在其中起到了重要作用，因為神經元極性決定了突觸生長方向。而RGCs

2、突觸生長方向對其損傷修復過程中指導再生纖維投射有重要意義，因此恢復RGCs極性將是促進視神經修復的新途徑。
　　miRNA是調節(jié)神經發(fā)育的重要因素之一，參與轉錄后基因表達調控，可能參與控制神經元極性。我們前期研究發(fā)現，miR-30b在視神經損傷早期表達迅速升高，在原代培養(yǎng)RGCs中促進其軸突生長，但具體作用機制還不清楚。Sema3A具有指導神經元突起生長的作用，且最近研究發(fā)現Sema3A參與調節(jié)海馬神經元極性，并且通過影響神經元內

3、cGMP/cAMP含量決定神經突起成為軸突或者樹突，這提示Sema3A可以調節(jié)RGCs極性。而且我們前期研究發(fā)現miR-30b對Sema3A表達具有抑制效應。因此我們推測miR-30b通過抑制Sema3A調節(jié)RGCs極性。
　　此外，視神經損傷后繼發(fā)性缺血缺氧是造成RGCs不可逆損失、影響再生修復的重要因素之一，目前認為氧剝奪損傷機制在其中發(fā)揮重要作用。近年的研究表明，MicroRNAs(miRNAs)參與機體內穩(wěn)態(tài)的調節(jié)，包括機

4、體組織對缺氧的應答反應。尤其miR-30b可以幫助視網膜色素上皮細胞抵抗氧化應激損傷。那么miR-30b是否對糖氧剝奪導致的RGCs損傷發(fā)揮保護作用呢？尚需要進一步實驗驗證。
　　本研究擬通過重組腺相關病毒轉染原代培養(yǎng)RGCs調節(jié)miR-30b含量，明確miR-30b通過抑制Sema3A表達影響RGCs極性;其次，明確miR-30b在糖氧剝奪損傷中對RGCs的保護作用。為miR-30b在中樞神經損傷修復中的應用提供了新的思路和理論

5、依據。
　　方法:1、利用體外培養(yǎng)的原代RGCs，分別轉染rAAV-miR-30b mimic、rAAV-miR-30binhibitor和rAAV-miR nc，培養(yǎng)7d后免疫組化雙熒光染色標記(Tubulin-Ⅲ/MAP2)區(qū)分RGCs軸突和樹突。熒光顯微鏡拍照記錄，利用IPP圖像分析軟件計數軸突/樹突長度，結合統(tǒng)計軟件分析miR-30b對RGCs極性的影響。
　　2、利用體外培養(yǎng)的原代RGCs，分別轉染rAAV-miR

6、-30b mimic、rAAV-miR-30binhibitor、rAAV-miR nc，以及結合應用SiRNA-Sema3A及Sema3A高濃度組，檢測Sema3A下游信號因子。
　　3、將原代培養(yǎng)的細胞采用rAAV-miR nc、rAAV-miR-30b mimic和rAAV-miR-30binhibitor處理，培養(yǎng)細胞6d。各組細胞分別進行低氧培養(yǎng)箱(37℃，體積分數5％CO2、17％N2、3％O2)聯合低糖（糖濃度為1.

7、0g/L）培養(yǎng)液進行培養(yǎng)以建立原代糖氧剝奪RGCs模型，并與正常培養(yǎng)(37℃、5％CO2)的細胞進行對照。采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測各組細胞活力，采用免疫熒光染色法檢測各組細胞中神經元特異性標志物TubulinⅢ的表達，并計算存活RGCs數目。采用Hoechst/PI染色法檢測各組細胞的凋亡和壞死情況。
　　結果:1、上調miR-30b可顯著增加原代培養(yǎng)RGCs軸突長度，顯著減少樹突個數;從而提高RGCs雙極性率。

8、反之下調miR-30b對RGCs軸突長度沒有顯著影響，樹突個數沒有顯著改變。
　　2、在原代培養(yǎng)RGCs中，上調miR-30b可顯著降低Sema3A蛋白表達。而干擾Sema3A表達后，Sema3A含量也顯著降低。反而下調miR-30b表達量對Sema3A沒有影響。上調miR-30b可顯著增加PKA活性，降低CRMP-2(T514)含量;同時在原提高Sema3A濃度可顯著降低PKA活性，增加CRMP-2(T514)含量。
　　

9、3、在經過糖氧剝奪處理后的原代培養(yǎng)RGCs中，上調miR-30b含量可見TubulinⅢ陽性細胞數量明顯增多，細胞活性明顯增強，以及細胞凋亡率和死亡率明顯降低。但下調miR-30b含量對TubulinⅢ陽性細胞數量沒有明顯改變。
　　結論:在體外培養(yǎng)的原代RGCs中miR-30b水平升高，可以促進軸突生長，抑制樹突生長，有助于維持RGCs雙極性特性。這一作用主要通過抑制Sema3A表達，進一步增強PKA活性，降低CRMP-2磷酸化