降血糖蛋白E2HSA的體外活性和體內(nèi)藥代動力學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　 研究多肽類降血糖藥物E2HSA的體外活性和動物體內(nèi)藥代動力學(xué)特點。
　　 方法:
　　 通過測定E2HSA和Exendin-4刺激胰島瘤細(xì)胞(RINm-5F細(xì)胞)產(chǎn)生cAMP的量來反映其體外生物活性;建立化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測法(CLEIA)測定獼猴血清中E2HSA和Exendin-4的濃度并對其進(jìn)行方法學(xué)確證;研究比較E2HSA和Exendin-4在獼猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征;采用硫酸銨鹽沉淀法結(jié)合C

2、LEIA研究E2HSA在獼猴體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化和活性形式研究。
　　 結(jié)果和結(jié)論:
　　 1.用E2HSA和Exendin-4刺激RINm-5F細(xì)胞,使其與細(xì)胞上的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體結(jié)合,孵育一段時間后,用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解,釋放出第二信使cAMP,用自主研發(fā)的免疫試劑盒測定細(xì)胞裂解釋放出的cAMP含量。隨著受體激動劑E2HSA、Exendin-4濃度的升高,細(xì)胞產(chǎn)生的cAMP量逐漸增多。但當(dāng)藥物濃度增加

3、到一定程度時,細(xì)胞產(chǎn)生的cAMP量達(dá)到一個平臺期,可能是由于藥物和細(xì)胞上的受體結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)。E2HSA和Exendin-4的EC50分別是9.121μmol·mL-1和0.07μmol·mL-1,表明E2HSA生物活性比Exendin-4的生物活性低,推測其原因,可能是由于E2HSA中連接有白蛋白,體積大,和細(xì)胞受體結(jié)合時E2HSA空間位阻影響了其親和力。
　　 2.建立了專屬性好、準(zhǔn)確、精密的CLEIA法分析生物樣品中E2

4、HSA和Exendin-4的含量,在E2HSA濃度2-500ng·mL-1范圍內(nèi)與其它類型白蛋白無明顯交叉反應(yīng),最低定量下限為2ng·mL-1,具有良好的線性關(guān)系。板內(nèi)精密度為2.5％0-7.2％,板間精密度為6.4％－15.2％,準(zhǔn)確度為.3.0％－1.2％。樣品穩(wěn)定性實驗表明,E2HSA3個質(zhì)控濃度的血清樣品在.80℃凍存6天穩(wěn)定,精密度為3.2％-7.9％,準(zhǔn)確度為-3.7％--10.1％,血清樣品稀釋50倍和100倍后無稀釋效應(yīng)

5、。Exendin-4的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍是1-100ng·mL-1,最低定量下限為100ng·mL-1,具有良好的線性關(guān)系。板內(nèi)精密度和板間精密度為5.3％-11.6％和1.1％-14.1％,準(zhǔn)確度為1.7％-7.0％。此方法能滿足E2HSA和Exendin-4的臨床前藥代動力學(xué)研究要求。
　　 3.獼猴單次皮下注射0.3mg·kg-1(39.3×10-10mol·kg-1)E2HSA后,清除半衰期是61.38h,AUC(0-t)是9

6、272.91ng·h·mL-1,CL是32.15mL·h·kg-1,MRT(0-t);是168.72h,獼猴單次皮下注射15μg·kg-1(42.97×10-10mol·kg-1)Exendin-4后,在6h后基本檢測不到血藥濃度,E2HSA的半衰期明顯延長。
　　 4.硫酸銨鹽沉淀法結(jié)合CLEIA法可以檢測E2HSA進(jìn)入動物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化情況,包括檢測原形E2HSA的濃度和其代謝產(chǎn)物Exendin-4的濃度。E2HSA進(jìn)入動物