生物大分子熒光探針的研究及應(yīng)用.pdf

1、廈門大學碩士學位論文生物大分子熒光探針的研究及應(yīng)用姓名：李芳申請學位級別：碩士專業(yè)：分析化學指導教師：郭祥群19980501I I 生物大分子熒光探針的研究及應(yīng)用以有效地使結(jié)合的H A 從D N A 中釋放出來，從而使H A 的熒光量子產(chǎn)率降低而猝滅體系的熒光。而碘猝滅效應(yīng)結(jié)果表明碘離子是有效的猝滅劑，在D N A 存在的情況下，K I 對體系熒光的猝滅程度加大。這些現(xiàn)象表明H A 是以非嵌入方式與D N A 結(jié)合的。隨后我們以H A

2、為探針，優(yōu)化了反應(yīng)條件，建立了D N A 與R N A 的新的熒光測定方法．結(jié)果表明H A 與D N A 結(jié)合后，H A 的熒光量子產(chǎn)率大大提高，并且體系相對熒光強度的增加程度與加入的D N A 量呈良好的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上我們建立了核酸的靈敏測定方法。對T - D N A 的測定來講，2 0 ％的R N A 不干擾測定。第二部分重點研究了紅區(qū)發(fā)射的熒光染料酚藏花紅( P S ) 與D N A 的作用方式。我們通過P s 與D N A

3、結(jié)合體系的熒光光譜、吸收光譜、及偏振實驗，證實了P s 的確結(jié)合到D N A 大分子上。隨后，應(yīng)用對照實驗，表明P s 不與胸腺嘧啶和三磷酸腺苷二鈉反應(yīng)，排除了P S 與D N A 以靜電吸引方式結(jié)合的可能性。通過碘猝滅實驗，發(fā)現(xiàn)P S 與D N A 結(jié)合后，K I 對其熒光猝滅程度明顯減小，證明了P S 以嵌入方式與D N A 結(jié)合。鹽效應(yīng)實驗結(jié)果表明，N a C ] 的加入不利于P S 與D N A 的結(jié)合反應(yīng)，這是由于D N A

4、在高鹽濃度介質(zhì)中，雙鏈團得較緊，使P S 不易嵌入其雙鏈，而易于被捧斥游離于溶液中，導致熒光強度回升。我們還考察了溫度的影響．發(fā)現(xiàn)熱變性后的D N A 與P s 的親合力降低。溴化乙錠( E B ) 及吖啶黃( A Y ) 的競爭實驗結(jié)果表明E B 及A Y 的加入均使P S —D N A 體系的熒光強度回升，這是由于E B 和A Y 與P S 競爭結(jié)合D N A 而使P s 從D N A 中游離出來的結(jié)果。E B 和A Y 是公認的嵌

5、入劑，這進一步證明了P S 是以嵌入作用方式與D N A 結(jié)合的。根據(jù)上述研究，在優(yōu)化實驗條件的基礎(chǔ)上，我們建立了P S 熒光猝滅法測定核酸的新方法。P S 與D N A 結(jié)合后，熒光量子產(chǎn)率大大降低，并且體系相對熒光強度的降低程度與加入的D N A 量呈良好的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上我們建立了核酸的靈敏測定方法。對D N A和R N A 混合樣品的測定結(jié)果表明，P s 對D N A 的靈敏度明顯比R N A 高．對于D N A 的測定來講，

6、1 0 倍量的R N A 不干擾測定。第三章我們探索了光化學熒光探針在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用。在這一章里，我們用9 ，1 0 ．蒽醌- 2 ，6 - 二磺酸鈉( A Q D S ) 作為外源光化學熒光探針來標記牛血清白蛋白( B S A ) ，研究T A Q D S 標記蛋白復合物A Q D S - B S A 的光化學熒光反應(yīng)特性，探索了光化學熒光分析( P C F ) 技術(shù)在蛋白質(zhì)性質(zhì)研究中的可能性與可行性。這一部分工作，由于可籍借的參