元胡止痛方治療偏頭痛的功效成分分析和作用機(jī)制研究.pdf

1、偏頭痛是一種嚴(yán)重的神經(jīng)血管性疾患，臨床常見為單側(cè)搏動性頭痛并伴有畏光、聲、某氣味，惡心，自主、認(rèn)知、情感和運(yùn)動障礙等癥狀。目前，偏頭痛的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，主要存在以下幾種學(xué)說：神經(jīng)源學(xué)說、血管源學(xué)說、三叉神經(jīng)血管源學(xué)說、生化因素、遺傳因素等?？蛊^痛藥物研發(fā)已取得較大進(jìn)展，現(xiàn)存藥物包括非甾體抗炎類、麥角類、曲坦類和阿片類藥物；另外多種多巴胺受體拮抗劑、硫酸鎂以及一些天然藥物等也被應(yīng)用于偏頭痛的治療。但這些藥物仍存在諸多不足，急需研發(fā)

2、新型抗偏頭痛藥物。
　　中藥應(yīng)用于疼痛治療已有數(shù)千年歷史，療效確切及毒副作用小等優(yōu)點已使中藥成為鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的熱點之一。元胡止痛方是中國臨床常用的止痛方劑，其組方藥物為延胡索和白芷兩味藥材；中國藥典規(guī)定其指標(biāo)性成分為延胡索乙素（多巴胺D2受體拮抗劑）。目前有研究將元胡止痛方應(yīng)用于偏頭痛的治療，并取得了良好的療效。然而，元胡止痛方治療偏頭痛的功效成分和作用機(jī)制并不清楚。
　　在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，中醫(yī)臨床用藥常用復(fù)方。中藥復(fù)方化學(xué)

3、成分非常復(fù)雜，其中何種成分為有效成分一直是廣大中藥研究工作者探尋之目標(biāo)。藥物只有通過與人體相互作用才能發(fā)揮藥效，人體口服中藥后，其復(fù)雜成分中，只有進(jìn)入血液循環(huán)，并到達(dá)相應(yīng)靶器官的成分才有可能是具有相應(yīng)藥理作用的活性成分。
　　因此，本研究系統(tǒng)地運(yùn)用了藥物分析、藥代動力學(xué)、組織分布，動物行為學(xué)和分子生物學(xué)等研究手段對元胡止痛方進(jìn)行了體內(nèi)外研究，旨在探討和闡明元胡止痛方治療偏頭痛的功效成分和作用機(jī)制，為揭示元胡止痛方的組方原理和創(chuàng)制高

4、效低毒、成分明確的治療偏頭痛藥物奠定基礎(chǔ)。
　　1實驗?zāi)康模?br>　　1.1建立元胡止痛方多成分分析方法，以確定其主要化學(xué)成分。
　　1.2建立元胡止痛方在大鼠血漿和腦組織中的成分分析方法，考察其進(jìn)入血液和腦組織的主要化學(xué)成分，并考察這些成分藥代動力學(xué)參數(shù)和腦組織分布特性。
　　1.3初步闡釋元胡止痛方及其主要成分組方延胡索乙素和歐前胡素對大鼠硝酸甘油型偏頭痛模型的作用機(jī)制。
　　2實驗方法：
　　2.1

5、元胡止痛方主要化學(xué)成分研究
　　2.1.1元胡止痛方制樣方法通過考察50％、75%、95%甲醇水溶液對元胡止痛方成分的提取效率，確定最終制樣所用提取溶劑濃度。
　　2.1.2元胡止痛方成分分析方法采用HPLC法分析元胡止痛方的化學(xué)成分。條件： Phenomenex Luna-C(18) column(250×4.6 mm，5.0μm)色譜柱；流動相：乙腈（Acetonitrile，AC）；0.1%磷酸三乙胺水溶液，pH5.6

6、（Phosphoric acid，triethylamine，pH5.6；PT5.6）；梯度洗脫程序：0~15 min，23%AC；15~26 min，23~40%AC；26~65 min，40~65%AC；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。
　　2.2元胡止痛方大鼠體內(nèi)成分分析
　　2.2.1元胡止痛方提取物制備方法同“元胡止痛方主要化學(xué)成分研究”制樣方法。
　　2.2.

7、2大鼠血漿和腦組織樣品制備方法大鼠灌胃元胡止痛方提取物后0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，10，12 h，通過眼底靜脈叢取血約0.4 mL于肝素抗凝管中抗凝，抗凝后置于4°C低溫離心機(jī)3500 r/min離心10 min后即得樣品。
　　大鼠灌胃元胡止痛方提取物后0，2，4，6，8，10 h迅速斷頭取腦，將其置于冰盤上，分離為大腦皮層（Cortex，Cor）、小腦（Cerebellum，Cer）、腦干（Brainstem

8、，Bra）、間腦（Diencephalon，Die）、紋狀體（Striatum，Str）、海馬（Hippocampus，Hip）等6部分。稱重后，以1:5比例加入0.9%生理鹽水，用高通量組織勻漿器勻漿；所得組織勻漿置于4°C低溫離心機(jī)離心機(jī)中，12000 r/min離心10 min，取上清液于離心管中。
　　2.2.3大鼠血漿和腦組織樣品預(yù)處理方法準(zhǔn)確吸取大鼠血漿、腦組織勻漿200μL于玻璃離心管中，加入20μL內(nèi)標(biāo)液混勻，2

9、mL乙酸乙酯-石油醚（1:1），渦旋混和5 min，2000 r/min離心10 min，所得萃取液置于潔凈的玻璃離心管中，氮吹儀中40°C吹干即得待測樣品。
　　2.2.4大鼠血漿樣品分析方法采用 HPLC法分析預(yù)處理樣品。條件：Phenomenex Luna-C(18) column（250×4.6 mm，5.0μm）色譜柱；流動相：AC：PT5.8（51:49）；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：血漿280 nm，腦組織230 n

10、m；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。
　　2.3元胡止痛方治療偏頭痛行為學(xué)研究
　　2.3.1機(jī)械刺激方法采用Von Frey機(jī)械測痛纖維絲，利用不同重量的纖毛壓力，按壓力從低到高順序作用于大鼠右側(cè)后肢腳掌中心部，引起大鼠的縮爪反應(yīng)，以引起50%縮爪反應(yīng)（作用5次，引起3次縮爪反應(yīng)）的纖毛壓力表示大鼠的機(jī)械痛閾值。
　　2.3.2熱刺激方法利用輻射熱刺激儀作用于大鼠右側(cè)后肢足底皮膚與玻璃板緊密接觸部，引起大鼠的縮

11、爪反應(yīng)，以引起縮爪反應(yīng)的所需時間表示大鼠的熱痛閾值。
　　2.4元胡止痛方對硝酸甘油型偏頭痛大鼠血中血管活性物質(zhì)水平的影響采用 NO一步法檢測元胡止痛方及其主要成分組方等對大鼠血漿中 NO含量影響；采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（Enzymelinked Immunosorbent Assay，ELISA）分別檢測元胡止痛方及其主要成分組方等對大鼠血漿中5-hydroxy tryptamine（5-HT）、Calcitonin gene

12、 related peptide（CGRP）、Histamine（HIS）的含量的影響。
　　2.5元胡止痛方對硝酸甘油型偏頭痛大鼠腦中活性成分水平的影響分別采用Western Blot和免疫熒光染色法觀察元胡止痛方及其主要成分組方等對大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)尾段中c-Fos，5-HT、CGRP、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）的影響。
　　3實驗結(jié)果：
　　3.1元胡止痛方主要化學(xué)成分研究建立的HPLC法能夠有效

13、分離元胡止痛方4種劑型中大部分成分，并定量分析了其中的12種成分，包括原阿片堿（Protopine，PTP）、別隱品堿（α-Allocryptopine，AYE）、黃連堿（Coptisine，CTE）、花椒毒酚（Xanthotol，XTL）、巴馬?。≒almatine，PME）、去氫紫堇堿（Dehydrocorydaline，DDE）、海罌粟堿（Glaucine，GCE）、延胡索乙素（Tetrahydropalmatine，THP）、四

14、氫小檗堿（Tetrahydroberberine，TDE）、歐前胡素（Imperatorin，IMP）、延胡索甲素（Corydaline，CDE）、異歐前胡素（Isoimperatorin，ISO），其中XTL、IMP、ISO來源于白芷，其余源于延胡索。這12種物質(zhì)中DDE、GCE，THP，IMP在元和止痛方各制劑中含量較高且較穩(wěn)定。
　　3.2元胡止痛方大鼠體內(nèi)成分分析
　　3.2.1血漿成分分析建立的HPLC法能夠有效分

15、離元胡止痛方入血的5種主要成分，并對這5種成分進(jìn)行了藥代動力學(xué)研究。結(jié)果表明，THP和GCE的達(dá)峰濃度（Cmax）和曲線下面積（AUC0-∞）高于其他三種成分（P＜0.05）；在生物堿中，THP和GCE的Cmax、AUC0-∞高于CDE（P＜0.05）；在香豆素中，IMP的Cmax、AUC0-∞高于ISO（P＜0.05）。生物堿的Cmax、AUC0-∞、半衰期（T1/2z）、平均滯留期（MRT0-∞）均高于香豆素，佐證了延胡索為方中君藥

16、。結(jié)果提示，THP、GCE和IMP有可能為元胡止痛方的最主要活性成分。
　　3.2.2腦組織成分分析入血的5種主要成分均能透過血腦屏障。建立的HPLC法能夠有效分離元胡止痛方入腦的5種主要成分，并對這5種成分進(jìn)行了腦組織分布研究。結(jié)果表明，THP和GCE在Cor、Cer、Bra、Die、Stri、Hip中Cmax高于其他3種成分（P＜0.05），THP的AUC0-∞最高（P＜0.05）；各成分在全腦中的分布情況，THP和GCE在S

17、tr的AUC0-∞高于腦其他部分（P＜0.05）；盡管CDE、IMP、ISO無法得到所有參數(shù)，但通過已有參數(shù)，可以推斷THP在腦組織各部分中綜合含量最高，IMP的綜合含量高于ISO，進(jìn)一步提示THP和IMP有可能為元胡止痛方治療偏頭痛的最主要的活性成分。
　　3.3元胡止痛方治療偏頭痛行為學(xué)研究元胡止痛方及其主要成分組方（THP、IMP）等相對于模型組能夠有效改善大鼠的機(jī)械刺激疼痛和熱刺激疼痛敏感性，其中元胡止痛方作用較主要成分組

18、方持久，而主要成分組方起效較快，且主要成分組方效果優(yōu)于主要成分單用；多巴胺D2受體激動劑喹吡羅能夠反轉(zhuǎn)元胡止痛方及其主要成分組方的作用；
　　3.4元胡止痛方對硝酸甘油型偏頭痛大鼠血中血管活性物質(zhì)水平的影響元胡止痛方及其主要成分組方（THP、IMP）等相對于模型組能夠有效的上調(diào)大鼠血漿中5-HT的含量，下調(diào) NO，CGRP，HIS的含量；喹吡羅能夠反轉(zhuǎn)元胡止痛方及其主要成分組方對5-HT，NO，CGRP的作用。
　　3.5元

19、胡止痛方對硝酸甘油型偏頭痛大鼠腦中活性物質(zhì)水平的影響元胡止痛方及其主要成分組方（THP、IMP）相對于模型組能夠有效的上調(diào)大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)（Ventrolateral periaqueductal gray，VLPAG）尾部5-HT的表達(dá)水平，下調(diào)c-fos，CGRP，nNOS的表達(dá)水平；喹吡羅能夠反轉(zhuǎn)元胡止痛方及其主要成分組方對c-fos，5-HT，CGRP，nNOS的作用。
　　4研究結(jié)論：
　　4.1建立

20、的高效液相色譜分析方法適用于元胡止痛方的大鼠體內(nèi)、外成分分析。結(jié)合本人碩士期間研究結(jié)果，進(jìn)一步確定THP和IMP可能為元胡止痛方的主要活性成分，為元胡止痛方有效成分進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　4.2首次證實元胡止痛方及其主要成分組方組（THP、IMP）可能主要通過中樞多巴胺D2受體發(fā)揮作用，有效上調(diào)硝酸甘油型偏頭痛大鼠頸靜脈血中5-HT，并下調(diào)NO，CGRP，HIS的含量，上調(diào)硝酸甘油型偏頭痛大鼠VLPAG尾部5-HT，并下調(diào)c-