背根神經(jīng)節(jié)中嘌呤能受體P2X3R介導(dǎo)骨癌痛的表觀調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性骨腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤導(dǎo)致的骨癌痛是一種嚴(yán)重且頑固性疼痛，嚴(yán)重影響或損害了病人的功能狀態(tài)，生活質(zhì)量以及生存時間。目前，對骨疼痛的分子機(jī)制還是不明確，有效的臨床治療手段有限。因此，迫切需進(jìn)一步探索骨癌痛發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以尋找新的治療靶點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤對骨質(zhì)的破壞以及酸中毒導(dǎo)致的炎癥發(fā)生，腫瘤釋放的產(chǎn)物，還有腫瘤引起的骨折、局部缺血、腫瘤入侵等導(dǎo)致的神經(jīng)纖維損傷都可能是引起骨癌痛的原因。有不少研究報導(dǎo)嘌呤能受體P2X3R在炎性

2、痛、神經(jīng)病理性疼痛和內(nèi)臟痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但對其在骨癌痛中作用功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究甚少。而在骨癌痛形成過程中，腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞會分泌些促炎相關(guān)因子來敏化外周初級傳入神經(jīng)元，引起神經(jīng)元中炎癥相關(guān)因子表達(dá)升高，其中NF-κB作為一種重要炎癥相關(guān)調(diào)控因子，廣泛參與炎癥，疼痛相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控，但在骨癌痛形成過程中 NF-κB是否參與調(diào)控P2X3R的表達(dá)仍然不清，因此，我們將從表觀遺傳的角度探討P2X3R的調(diào)控特征及其NF-κB

3、的作用特點，以尋求治療骨癌痛的新靶點，為臨床治療骨癌痛提供理論依據(jù)。
　　第一部分：研究P2X3R和NF-κB是否參與骨癌痛的發(fā)生發(fā)展
　　1.目的:
　　(1)檢測骨癌模型大鼠是否存在痛覺過敏及其相關(guān)電生理機(jī)制；
　　(2)研究P2X3R是否參與骨癌痛的發(fā)生發(fā)展；
　　(3)探討NF-κB介導(dǎo)大鼠骨癌痛的作用機(jī)制。
　　2.實驗方法
　　(1)實驗研究對象為雌性成年SD大鼠。通過將大鼠乳腺癌W

4、alker256細(xì)胞(4×105個)注射到脛骨的骨髓腔內(nèi)來建立骨癌痛大鼠模型。應(yīng)用 X射線成像及組織形態(tài)學(xué)方法檢測脛骨形態(tài)學(xué)變化以驗證模型建立是否成功，用vonFrey filament(VFF)和熱刺激儀分別檢測機(jī)械痛閾和熱痛閾，以及雙足平衡儀檢測雙足平衡差異來評價骨癌誘導(dǎo)的痛覺過敏；
　　(2)用DiI逆行示蹤劑標(biāo)記支配大鼠脛骨特異性DRG神經(jīng)元；
　　(3)用Real-time PCR和Western blotting

5、方法檢測大鼠脛骨相關(guān)的DRG中NF-κB家族成員RelB，p52，p65 p-p65和RANKL，以及嘌呤受體P2X3R，P2X1R，P2X2R，CBS（硫化氫合成酶）的表達(dá)情況；
　　(4)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測支配大鼠脛骨特異性DRG神經(jīng)元的ATP電流；
　　(5)檢測嘌呤能受體抑制劑Suramin或P2X3R和P2X2/3R強(qiáng)效抑制劑A317491能否翻轉(zhuǎn)骨癌大鼠痛敏來確定P2X3R是否參與骨癌痛的發(fā)生；
　　(

6、6)檢測p65抑制劑PDTC或BAY-11-7082能否翻轉(zhuǎn)骨癌大鼠痛敏來確定p65是否參與骨癌痛形成；
　　(7)檢測鞘內(nèi)注射p65 shRNA慢病毒是否降低脛骨特異性神經(jīng)元興奮性和骨癌痛敏行為，進(jìn)一步確定p65是否參與骨癌痛的形成。
　　3.實驗結(jié)果
　　(1)乳腺癌細(xì)胞注射兩周后 X射線成像和形態(tài)學(xué)觀察到骨癌大鼠脛骨骨質(zhì)發(fā)生明顯破壞，脛骨骨髓腔中充滿大量癌細(xì)胞；行為學(xué)檢測顯示骨癌大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺過敏；
　

7、　(2)熒光逆行示蹤劑 DiI標(biāo)記的支配大鼠脛骨特異性神經(jīng)元主要分布在腰段L2-L5這4個節(jié)段的DRG中；
　　(3)電生理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，腫瘤細(xì)胞注射兩周后，骨癌大鼠脛骨特異性DRG神經(jīng)元的ATP電流顯著增強(qiáng)，ATP誘發(fā)的動作電位個數(shù)也顯著增加；
　　(4)癌細(xì)胞注射兩周后大鼠脛骨相關(guān)的DRG中P2X3R表達(dá)顯著上調(diào)。鞘內(nèi)分別注射嘌呤能受體抑制劑Suramin，P2X3R和P2X2/3R強(qiáng)效抑制劑A317491能

8、顯著緩解骨癌大鼠的痛覺過敏，效果呈時間和劑量依賴性；
　　(5)癌細(xì)胞注射兩周后顯著增加大鼠脛骨相關(guān)的DRG中p65及磷酸化p65的表達(dá)，用p65抑制劑PDTC或BAY-11-7082能顯著減輕骨癌大鼠的痛覺過敏，緩解效果呈現(xiàn)時間和劑量依賴性；
　　(6)鞘內(nèi)注射p65 shRNA慢病毒能顯著緩解骨癌大鼠的痛敏行為，降低 ATP誘發(fā)的電流，減少ATP誘發(fā)的動作電位個數(shù)。
　　4.小結(jié)
　　以上結(jié)果提示P2X3R和

9、p65均參與了癌細(xì)胞誘導(dǎo)的骨癌大鼠痛覺過敏的發(fā)生發(fā)展，且P2X3R的功能受到了p65的調(diào)控。
　　第二部分：研究NF-κB參與P2X3R表達(dá)調(diào)控的分子及表觀遺傳學(xué)機(jī)制
　　1.目的:
　　(1)分析NF-κB p65和P2X3R兩者表達(dá)的相關(guān)性，檢測其是否共定位于大鼠脛骨特異性DRG神經(jīng)元中；
　　(2)檢測p65特異性抑制劑或LV-p65 shRNA沉默p65表達(dá)是否可以抑制P2X3R表達(dá)；
　　(3)生

10、物學(xué)軟件預(yù)測p2x3r基因啟動子區(qū)CpG島上可能存在的p65結(jié)合位點，并進(jìn)一步用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）進(jìn)行驗證；
　　(4)檢測p2x3r基因啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化情況，探討甲基化狀態(tài)的改變對p65與其結(jié)合的影響；
　　(5)初步探討p2x3r基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)發(fā)生改變的機(jī)制，即檢測骨癌大鼠脛骨相關(guān)的DRG中主動去甲基化相關(guān)的蛋白MBD2，MBD4，Gadd45a，TDG以及被動去甲基化的DNA甲

11、基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和DNMT3b表達(dá)變化情況。
　　2.實驗方法
　　(1)應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)分析 p65和 P2X3R兩者的表達(dá)是否存在相關(guān)性。用免疫熒光染色檢測p65與P2X3R在脛骨特異性DRG神經(jīng)元上的共定位情況；
　　(2)檢測p65抑制劑PDTC或p65 shRNA慢病毒能否逆轉(zhuǎn)P2X3R的高表達(dá)，以進(jìn)一步驗證p65是否調(diào)控P2X3R表達(dá)；
　　(3)應(yīng)用生物學(xué)軟件Gene regulation（alib

12、aba2）在線預(yù)測p2x3r基因啟動子區(qū)CpG島上的p65結(jié)合位點，用染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）進(jìn)一步驗證；
　　(4)應(yīng)用MSP（甲基化特異性 PCR）和BSP（重亞硫酸氫鹽測序PCR）檢測大鼠脛骨相關(guān)的DRG中p2x3r基因啟動子區(qū)的甲基化情況；
　　(5)應(yīng)用Real-time PCR方法檢測大鼠脛骨相關(guān)的DRG中DNMT3a，DNMT3b，Gadd45a，MBD2，MBD4和TDG的表達(dá)情況。
　　3.實驗結(jié)

13、果
　　(1)在骨癌痛模型大鼠脛骨相關(guān)的DRG中p65和P2X3R兩者表達(dá)呈相關(guān)性；p65與P2X3R共表達(dá)于大鼠脛骨特異性DRG神經(jīng)元中；
　　(2)p65抑制劑PDTC或p65 shRNA慢病毒能顯著抑制骨癌大鼠脛骨相關(guān)的DRG中P2X3R的表達(dá)；
　　(3)在線軟件預(yù)測p2x3r基因啟動子區(qū)CpG島上存在5個p65結(jié)合位點，染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)檢測顯示p65與CpG島上1，4和5這三個位點均有結(jié)合，且在第

14、1位點上骨癌痛組結(jié)合顯著增強(qiáng)；
　　(4)骨癌痛大鼠脛骨相關(guān)的DRG中p2x3r基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生明顯的去甲基化；
　　(5)骨癌大鼠脛骨相關(guān)的DRG中DNMT3a和DNMT3b表達(dá)水平顯著降低，但Gadd45a，MBD2，MBD4和TDG的表達(dá)沒有發(fā)生顯著變化。
　　4.小結(jié)
　　癌細(xì)胞注射引起的大鼠脛骨相關(guān)DRG中的P2X3R高表達(dá)可能是由于其啟動子區(qū)CpG島去甲基化增強(qiáng)進(jìn)以及與p65結(jié)合增加導(dǎo)致的；p

15、2x3r基因啟動子區(qū)CpG島上去甲基化可能是由于DNMT3a和DNMT3b表達(dá)下降所致，這些結(jié)果提示DNA甲基化參與調(diào)控骨癌痛的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論:
　　(1)癌細(xì)胞注射引起p2x3r基因啟動子區(qū)DNA去甲基化增強(qiáng)以及與p65結(jié)合增加，導(dǎo)致P2X3R表達(dá)增加，ATP電流增強(qiáng)，從而產(chǎn)生骨癌大鼠痛覺過敏；
　　(2)DNMT3A和DNMT3B表達(dá)下降可能是引起p2x3r基因啟動子DNA去甲基化原因之一，提示表觀調(diào)控參與骨