固有免疫受體NOD2在心室重構(gòu)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的
　　心室重構(gòu)是指心室受到損傷時(shí)發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能的改變，出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大、死亡、間質(zhì)纖維化、心肌肥厚、心肌細(xì)胞膜離子通道、交感神經(jīng)支配的變化等。許多心血管疾病如高血壓、心肌梗死、心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病、心臟瓣膜病等都存在心室重構(gòu)現(xiàn)象，另外在高同型半胱氨酸血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等其他疾病并發(fā)癥中也存在心室重構(gòu)現(xiàn)象。心室重構(gòu)是多種因素共同作用所產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、病理生理學(xué)、電生理環(huán)境的變化，其機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)、

2、血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷、細(xì)胞因子生成和蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)降解。
　　NOD樣受體（NOD-likereceptor，NLRs）是一類新型胞漿內(nèi)的固有免疫模式識(shí)別受體，識(shí)別細(xì)胞內(nèi)病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子(dangers-associatedmolecularpatterns，DAMP

3、s)，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答，在自身免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)了22個(gè)NLR家族成員，其中最具代表性的是NOD1(nucleotide-bindingoligomerizationdomaincontaining1)和NOD2(nucleotide-bindingoligomerizationdomaincontaining2)。有文獻(xiàn)報(bào)道，NOD1激動(dòng)劑iEDAP注射小鼠心臟，激活NF-κB（nucleartranscript

4、ionfactorκB）和TGF-β（transforminggrowthfactorβ）信號(hào)通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死和凋亡進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能異常。但有關(guān)NOD2在心臟中表達(dá)及在心室重構(gòu)中的作用，迄今尚未見報(bào)道。為此，本課題選用高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，hHcys)及心肌梗死（myocardialInfarction，MI）兩種不同程度的心室重構(gòu)模型，探討NOD2是否參與心室重構(gòu)過程，并就NOD2調(diào)節(jié)心室

5、重構(gòu)過程的可能機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　研究方法
　　第一部分:通過無葉酸飲食建立WT和CBS+/-小鼠高同型半胱氨酸血癥模型，利用小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠左心室內(nèi)徑及心功能，WesternBlot、RT-PCR和免疫組化等方法檢測(cè)NOD2在心肌組織中的表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn)用不同濃度的L-Hcy刺激大鼠心肌細(xì)胞H9C2和平滑肌細(xì)胞(smoothmusclecell，SMC)，WesternBlot方法檢測(cè)NOD2的蛋白表達(dá)水平。

6、為探討NOD2在高同型半胱氨酸血癥心室重構(gòu)中的機(jī)制，我們采用NOD2敲基因鼠建立高同型半胱氨酸血癥模型，進(jìn)一步利用小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠左心室內(nèi)徑及心功能指標(biāo)，觀察NOD2對(duì)hHcys引起心室重構(gòu)的影響;Masson染色觀察小鼠纖維化程度;通過WesternBlot方法檢測(cè)心室重構(gòu)標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9，

7、MMP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissueinhibitorofmetalloproteinase1，TIMP-1)等指標(biāo)的表達(dá)變化。
　　第二部分:通過永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立小鼠心肌梗死模型。在心梗后3、7、14和28天分別收集梗死區(qū)和非梗死區(qū)的心肌組織，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同梗死時(shí)間后NOD2的mRNA表達(dá)水平，通過免疫組化染色和WesternBlot分析心梗NOD2的蛋白表達(dá)水平。為進(jìn)一步明確NOD2在

8、心梗左室重構(gòu)中的作用，采用NOD2敲基因小鼠建立心肌梗死模型，小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心肌梗死的小鼠左心室內(nèi)徑及心功能。通過Masson和Tunel染色觀察野生和NOD2-/-小鼠心梗后纖維化程度及細(xì)胞調(diào)亡情況，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)測(cè)定組織的促炎細(xì)胞因子水平，心肌組織裂解液運(yùn)用WesternBlot和明膠酶譜法檢測(cè)MMP9、MMP2蛋白及活性變化，并用免疫組化染色觀察心

9、梗后炎性細(xì)胞浸潤和心臟成纖維細(xì)胞（cardiacfibroblast，CF）轉(zhuǎn)分化成心肌成纖維細(xì)胞情況。體外實(shí)驗(yàn)采用小鼠原代成纖維細(xì)胞探討NOD2參與心室重構(gòu)的分子機(jī)制，運(yùn)用WesternBlot等方法測(cè)定胞壁酰二肽（MuramylDipeptide，MDP）刺激成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生的p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellularregulatedproteinkinases1/2，ERK1/2)磷酸化水平及成纖維細(xì)胞缺氧4h復(fù)氧不

10、同時(shí)間后NOD2和MMP9蛋白表達(dá)水平;ELISA檢測(cè)MDP刺激成纖維細(xì)胞及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后缺氧4h復(fù)氧24h產(chǎn)生的炎性因子變化水平。
　　結(jié)果
　　第一部分:①NOD2隨著血漿Hcy濃度的升高蛋白表達(dá)增加，在CBS+/-模型組中表達(dá)最強(qiáng)，其次是WT模型組。免疫組化和PCR結(jié)果同樣證實(shí)，NOD2在CBS+/-模型組中的表達(dá)最強(qiáng)。②利用不同濃度的L-Hcy刺激大鼠心肌細(xì)胞H9C2，發(fā)現(xiàn)NOD2的表達(dá)成濃度依賴性上調(diào)，其中，L-

11、Hcy濃度在25μmol/L時(shí)，NOD2表達(dá)最強(qiáng);不同濃度的L-Hcy刺激SMC，NOD2的表達(dá)同樣顯著上調(diào)。③心室重構(gòu)標(biāo)志物MMP9在WT模型中表達(dá)顯著升高，NOD2敲除后MMP9表達(dá)降低;COL1在WT模型中表達(dá)降低，而NOD2敲除后COL1表達(dá)升高。雖然NOD2能影響MMP9、COL1的蛋白表達(dá)，但是NOD2缺失未能減輕hHcys引起的心室重構(gòu)。相比于WT對(duì)照組，WT模型組的左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)，左室收縮末期內(nèi)徑(LVI

12、Ds)增大，說明左室肥大;左室舒張末期后壁厚度(LVPWd)和左室收縮末期后壁厚度(LVPWs)降低則表明左室壁變薄。而NOD2敲基因鼠高同型半胱氨酸血癥后的左室肥大和室壁變薄現(xiàn)象并沒有改變，說明NOD2基因敲出后未能減輕hHcys引起的心室重構(gòu)。
　　第二部分:①首次證實(shí)，NOD2在心梗組織中表達(dá)升高。與假手術(shù)組相比，MI組非梗死區(qū)和梗死區(qū)NOD2mRNA表達(dá)水平明顯升高，其中梗死區(qū)NOD2的mRNA表達(dá)變化水平最高，而且呈時(shí)間

13、依賴性變化;WesternBlot和免疫組化結(jié)果同樣證實(shí)了心梗后NOD2表達(dá)升高。②NOD2缺失能減輕心梗后心肌功能失常和心肌重構(gòu)的發(fā)生。通過超聲心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)，NOD2-/-心梗組心功能損傷明顯改善;WT心梗后變化的左室直徑和室壁厚度在NOD2-/-敲基因鼠模型中也有所減輕，心肌重構(gòu)減弱;TUNEL和Masson染色顯示在NOD2-/-心梗組，細(xì)胞凋亡和心肌纖維化程度明顯降低。③我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NOD2缺失能降低心梗區(qū)炎性因子水平，炎性細(xì)

14、胞的浸潤及MMP-9的活性。心梗發(fā)生后，TGF-β、白介素1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TumorNecrosisFactor，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocytechemoattractantprotein，MCP-1)等炎性因子水平顯著升高，而NOD2缺失能降低這些炎性因子的水平。小鼠心肌梗死后MMP9的蛋白和活性都升高，NOD2缺失后減弱了MI導(dǎo)致的MMP9蛋白和活性水平的提高。炎性細(xì)胞

15、浸潤在NOD2-/-心梗組中表達(dá)也顯著降低。④MDP誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞有絲分裂原激活蛋白激酶（Mitogenaetivatedproteinkinase，MAPK）信號(hào)通路的激活和促進(jìn)促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。我們利用NOD2激活劑MDP刺激心肌成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P38、ERK-1/2等激酶的磷酸化水平增加;IL-1β、TNF-α、TGF-β、MCP-1、IL-8、細(xì)胞間黏附因子1(Intercellularadhesionmolecule，ICA

16、M-1)等促炎介質(zhì)表達(dá)水平顯著升高。⑤NOD2沉默減弱缺氧誘導(dǎo)的MMP9表達(dá)。在原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中，缺氧/復(fù)氧顯著增加NOD2和MMP9的表達(dá)，NOD2基因沉默后，缺氧誘導(dǎo)的MMP9表達(dá)和促炎介質(zhì)的表達(dá)受到抑制。
　　結(jié)論
　　1.本文首次探討了NOD2在高同型半胱氨酸血癥(hHcys)導(dǎo)致心室重構(gòu)中的作用，發(fā)現(xiàn)NOD2在CBS+/-造模的hHcys小鼠心肌組織中蛋白及mRNA水平顯著升高;利用NOD2敲基因鼠進(jìn)一步

17、研究發(fā)現(xiàn)，NOD2缺失雖能降低心室重構(gòu)標(biāo)志物MMP9的表達(dá)，但對(duì)高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的心室重構(gòu)沒有改善作用。分析原因一是高同型半胱氨酸血癥對(duì)心臟的損傷較小，只影響左室舒張內(nèi)徑和左室后壁厚度而對(duì)心臟收縮及舒張功能沒有影響，因此NOD2缺失后的改善作用未能體現(xiàn)出來。二是NOD2敲除后可能衍生出別的代償機(jī)制從而影響高同型半胱氨酸血癥引起的心臟損傷，具體機(jī)制需進(jìn)一步明確。
　　2.建立冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎心肌梗死模型，研究NOD2是否參

18、與心肌梗死導(dǎo)致的心室重構(gòu)過程。我們證實(shí)，在心肌梗死區(qū)和非梗死區(qū)NOD2mRNA表達(dá)水平明顯升高，其中梗死區(qū)NOD2的mRNA表達(dá)變化水平最高。利用NOD2敲基因鼠進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NOD2缺失能減輕心梗后心功能障礙和心肌重構(gòu)的發(fā)生，細(xì)胞凋亡和心肌纖維化程度也明顯降低。研究表明，NOD2通過調(diào)控MMP9蛋白及活性、炎性介質(zhì)水平和炎性細(xì)胞浸潤來介導(dǎo)心肌梗死后左室重構(gòu)過程。體外采用小鼠心臟原代成纖維細(xì)胞，研究表明MDP誘導(dǎo)激活了心肌成纖維細(xì)胞M