NOD2信號(hào)增強(qiáng)對(duì)負(fù)載白血病抗原的樹突狀細(xì)胞的作用研究.pdf

1、　　目的：探討胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)激活NOD2信號(hào)通路對(duì)負(fù)載白血病抗原的致敏樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DCs)的免疫調(diào)控作用。
　　方法：(1)梯度離心法獲取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),體外給予重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimul

2、ating factor , rhGM-CSF )、重組人白介素-4 ( recombinant human interleukin-4,rhIL-4)、重組人腫瘤壞死因子α(recombinant human tumor necrosis factorα,rhTNF-α)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天,誘導(dǎo)第5天給予白血病細(xì)胞株HL-60凍融抗原致敏DCs,得到致敏DCs。(2)給予不同濃度MDP(1000ng/ml, 2000ng/ml,3000ng

3、/ml)刺激致敏DCs,作用24小時(shí),半定量RT-PCR檢測(cè)NOD2 mRNA的表達(dá),觀察不同濃度MDP對(duì)致敏DCs內(nèi)NOD2的表達(dá)影響。(3)實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)共分為四組,即不給于任何刺激的成熟DCs組、成熟DCs+MDP組(MDP2000ng/ml,24h),負(fù)載白血病細(xì)胞HL-60凍融抗原致敏DCs組(簡(jiǎn)稱致敏DCs組)、致敏DCs+MDP組(MDP2000ng/ml,24h)。(4) RT-PCR和western-blot分別檢測(cè)N

4、OD2 mRNA和蛋白表達(dá)。(5)流式細(xì)胞儀分析各組DCs表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD40的表達(dá)。(6)ELISA法檢測(cè)各組DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)用貼壁法得到的PBMC,經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,其形態(tài)以及流式表型符合DCs細(xì)胞特點(diǎn)。(2)用不同濃度MDP刺激致敏DCs后,RT-PCR結(jié)果顯示,隨著MDP濃度增加,NOD2 mRNA的表達(dá)顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

5、0.05)。(3) MDP作用于經(jīng)不同方式處理的DCs后,各組DCs內(nèi)NOD2 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào),并以致敏DCs+MDP組最高,其作用顯著高于僅給予MDP刺激的DCs+MDP組和無(wú)MDP刺激的致敏DCs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(4)流式細(xì)胞術(shù)顯示各組DCs表面分子(HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD40)表達(dá)變化規(guī)律基本一致,以致敏DCs+MDP組表達(dá)最高依次為(96.23±3.67)%,(76.83

6、. ±5.83)%,(45.23±4.92)%, (72.33±7.00)%,(45.53±1.53)%,其明顯高于DCs+MDP組和致敏DCs組,未處理DCs表達(dá)最低,即(80.27±5.36)%,(49.27±2.24)%,(25.50±4.60)%,(45.23±4.92)%, (23.80±1.15)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(5)與無(wú)任何處理的DCs組比較,給予MDP刺激或凍融抗原致敏后,IL-12p40分泌增加,

7、且DCs+MDP組(573.86± 32.09pg/ml)高于致敏DCs組(365.03±28.86 pg/ml),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),以致敏DCs+MDP分泌細(xì)胞因子IL-12p40最高為(898.30±61.08)pg/ml。
　　結(jié)論：(1)MDP可以上調(diào)致敏DCs內(nèi)NOD2的表達(dá),其上調(diào)水平與MDP的濃度成正相關(guān)。(2)MDP上調(diào)致敏DCs內(nèi)NOD2 mRNA和蛋白表達(dá)的同時(shí),可以促進(jìn)致敏DCs 表面HL