構(gòu)巢曲霉乙醇誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用于煙草莖尖生長控制的初步研究.pdf

1、在過往的植物基因表達研究中，由于自然突變體的不易獲得，同時人工誘發(fā)的突變體通常不能依照所期望的結(jié)果去表達，這給繼續(xù)開展植物基因表達研究工作造成了很大的困難?，F(xiàn)在的研究者通過在所要表達的目的基因上游建立一個有效的“基因開關(guān)”，構(gòu)建出可準確調(diào)控的基因表達系統(tǒng)而實現(xiàn)對基因表達的人工調(diào)控，使目的基因定時、定量、定位的表達。
　　 為了分析植物發(fā)育過程中某一基因的功能，在時間和空間上控制基因表達是一種理想手段。化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)中的乙醇誘導(dǎo)基因

2、表達系統(tǒng)可以起到這種功效。在乙醇存在的情況下，基因表達激活受控于一個響應(yīng)alcR調(diào)控的alcA啟動子。表達alcR的組織特異性啟動子可以精確控制基因在有限空間內(nèi)的表達。從而實現(xiàn)體外施加誘導(dǎo)劑乙醇的操縱下，對轉(zhuǎn)化株體內(nèi)的目的基因的表達實現(xiàn)可控性。此外，在乙醇系統(tǒng)下，報告基因的激活和失活，遵循乙醇誘導(dǎo)的頻次，該動力學(xué)現(xiàn)象說明乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)是動態(tài)的、高度靈敏的，并且適合在時間上精確控制基因表達，研究某一種性狀的可恢復(fù)性改變。
　　 RN

3、A沉默(RNAsilencing)是真核生物體內(nèi)普遍保守的、發(fā)生在RNA水平的、基于核酸序列同源性相互作用的一種對基因表達的調(diào)控機制。通過設(shè)計反向重復(fù)序列構(gòu)建在植物體內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA來誘導(dǎo)RNA沉默的方法是一條非常有效的植物基因研究途徑。將可以在植物體內(nèi)造成某一基因沉默的反向重復(fù)構(gòu)件，作為乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)下的操控對象，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)特定區(qū)域的可恢復(fù)性基因沉默。對乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)在實際研究中的進一步發(fā)展使得該系統(tǒng)本身具有了更廣闊和完善的使用空

4、間。
　　 本實驗設(shè)計正是在上述研究思路下，將植物莖尖分生組織中特異性啟動子WUSP及細胞骨架蛋白基因ACTIN的RNA沉默構(gòu)件結(jié)合到乙醇誘導(dǎo)表達系統(tǒng)中，力圖在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功后，實現(xiàn)對實驗對象煙草的頂端生長控制。
　　 試驗過程中培養(yǎng)了構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans），提取基因組，設(shè)計特異性引物，PCR擴增獲得了乙醇誘導(dǎo)表達系統(tǒng)所需的啟動子alcAP;另提取構(gòu)巢曲霉總RNA，RT-PCR擴增獲得調(diào)控

5、因子alcR全序列;培養(yǎng)野生型擬南芥（Arabidopsisthaliana），提取基因組，PCR擴增獲得莖尖干細胞調(diào)控區(qū)特異表達的啟動子WUSP;提取煙草（NicotianatabacumL.）基因組，PCR擴增獲得管家基因肌動蛋白ACTIN的部分序列，作為干擾序列;獲得重組表達載體，由WUSP控制alcR的表達，由alcAP控制ACTIN干擾序列的表達;重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404后，得到重組農(nóng)桿菌菌株P(guān)CA3301-AA，使用

6、農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草獲得帶有該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株。
　　 同時構(gòu)建乙醇誘導(dǎo)下的GUS檢測系統(tǒng)，使用該重組表達載體對乙醇誘導(dǎo)的實效性進行瞬時表達驗證:由CaMV35S啟動子控制alcR的表達，由alcAP控制GUS基因的表達;重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌菌株P(guān)CA3301-AG，該菌株侵染煙草NC89葉片，乙醇誘導(dǎo)，暗環(huán)境下共培養(yǎng)，第4天進行GUS表達的組織化學(xué)染色。
　　 論文實驗完成了對乙醇誘導(dǎo)表