rCM、rEC和rHspX蛋白的全血IFN-γ釋放試驗(yàn)診斷結(jié)核分枝桿菌感染的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　結(jié)核分枝桿菌(Mycobac teriumtu berculosis,M.tb)RD2區(qū)編碼抗原:培養(yǎng)濾液蛋白21(Culture filtrate protein 21,CFP21)和M.tb主要蛋白64(Major proteinofmycobac teriumtuberculosis64,MPT64),僅在M.tb和部分BCG菌株中表達(dá)。M.tbRD1區(qū)編碼抗原:培養(yǎng)濾液蛋白10(Culture filtr

2、ate protein10,CFP10)和6kDa早期分泌性靶抗原(6kDa Early secret aryan tigenictarget,ESAT-6),存在于M.tb早期培養(yǎng)濾液里,且在全部BCG菌株及絕大部分非結(jié)核分枝桿菌(Non tuberculosis mycobacteria,NTM)不表達(dá)。HspX是M.tb休眠期或潛伏感染期高表達(dá)的蛋白。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦?通過基因工程技術(shù),分別將HspX、或CFP21和MPT6

3、4,ESAT6和CFP10構(gòu)建成CFP21-MPT64(rCM)和ESAT-6-CFP10(rEC)融合蛋白,在大腸桿菌中表達(dá)純化。本課題以這三種蛋白為基礎(chǔ)建立診斷M.tb感染的全血IFN-γ釋放試驗(yàn)(Whole-bloodIFN-γassay,WBIA)并初步評(píng)價(jià)這種診斷方法的診斷價(jià)值,為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.rCM、rEC和rHspX蛋白的純化、定量和鑒定;
　　2.健康人(Health)

4、、結(jié)核桿菌潛伏感染人群(LTBI)和痰涂片陽(yáng)性結(jié)核病患者(SPTB)的篩查和鑒定;
　　3.全血IFN-γ釋放試驗(yàn)(WBIA)檢測(cè)受檢者血清中IFN-γ的含量,用spss17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,評(píng)價(jià)rCM-WBIA、rEC-WBIA和rHspX-WBIA單獨(dú)和聯(lián)合使用診斷M.tb的價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1.成功純化rCM、rEC和rHspX蛋白。凍干后,用1mL1×PBS溶解并過濾除菌并將蛋白保存于-20℃待用

5、。純化產(chǎn)物的大小和純度,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定符合預(yù)期。
　　2.Health選用同濟(jì)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)新生,新鄉(xiāng)市和濟(jì)寧市結(jié)核病防治所共120人,臨床體格檢查正常,胸部X光檢查正常,TST陰性。LTBI選用同濟(jì)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)新生,新鄉(xiāng)市和濟(jì)寧市結(jié)核病防治所共92人,臨床體格檢查正常,胸部X光檢查正常,TST陽(yáng)性,痰涂片陰性。SPTB選用新鄉(xiāng)市和濟(jì)寧市結(jié)核病防治所共43人,有明顯臨床癥狀,胸部X光檢查有結(jié)核病灶,TST陽(yáng)性或強(qiáng)

6、陽(yáng)性,痰涂片陽(yáng)性。
　　3.rCM分別刺激Health,LTBI和SPTB的全血釋放的IFN-γ含量的Mean±sd分別為117.3±116.8pg/mL,790.7±876.5pg/mL和728.5±672.0pg/mL;SPTB和Health以及LTBI與Health之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。rEC分別刺激Health,LTBI和SPTB的全血釋放的IFN-γ含量的Mean±sd分別為119.3±105.0pg/

7、mL,961.3±1112.8pg/mL和1050.9±917.6pg/mL;SPTB和Health以及LTBI與Health之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。rHspX分別刺激Health,LTBI和SPTB的全血釋放的IFN-γ含量的Mean±sd分別為25.8±76.7pg/mL,86.5±251.7pg/mL和130.2±208.5pg/mL;LTBI與Health,以及SPTB與Health之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.

8、001)。PHA分別刺激Health,LTBI和SPTB的全血釋放的IFN-γ含量的Mean±sd分別為1274.1±1665.0pg/mL,2604.4±1805.7pg/mL和2456.2±2985.8pg/mL;SPTB與Health之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　4.rCM-WBIA和rEC-WBIA單獨(dú)診斷總?cè)巳褐械腗.tb感染人群(包括SPTB和LTBI):受試者工作特征(Receiver Operatin

9、g Characteristic,ROC)曲線下面積(Area under curve,AUC)分別為0.855和0.877,cut-off值分別為393.4pg/mL和352.2pg/mL,靈敏度分別為64.4％和74.8%,特異度分別為100%和98.3%。rCM-WBIA和rEC-WBIA串聯(lián)(兩種方法均為陽(yáng)性才是陽(yáng)性)和并聯(lián)(兩種方法之一為陽(yáng)性即是陽(yáng)性)診斷總?cè)巳褐械腗.tb感染人群的靈敏度分別為51.1%和87.4%,特異度分

10、別為100%和98.3%。
　　rCM-WBIA和rEC-WBIA單獨(dú)診斷M.tb感染人群中的SPTB的靈敏度分別為62.8%和86.0%,特異度分別為35.9%和30.4%。rCM-WBIA和rEC-WBIA串聯(lián)和并聯(lián)診斷M.tb感染人群中SPTB的靈敏度分別為60.5%和88.4%,特異度分別為53.3%和13.0%。
　　5.rCM-WBIA和rEC-WBIA單獨(dú)診斷總?cè)巳褐械腗.tb感染人群一致性極差,符合率為63.

11、7%,κ=0.16。rCM-WBIA和rEC-WBIA單獨(dú)診斷M.tb感染人群中的SPTB一致性極差,符合率為72.1%,κ=0.316。
　　6.rHspX-WBIA診斷M.tb感染人群中的LTBI的cut-off值為54.2pg/ml,靈敏度和特異度分別為23.8%和52.6%。
　　結(jié)論：
　　1.診斷總?cè)巳褐械腗.tb感染人群宜選用rCM-WBIA和rEC-WBIA并聯(lián);
　　2.診斷M.tb感染人群中的