SigB(Q225P)突變促進金黃色葡萄球菌生物被膜形成的作用與機制研究.pdf

1、生物被膜(biofilm，BF)是指附著在有生命體或非生命體表面的由細菌自身分泌的胞外多聚物包裹細菌所形成的膜樣物。胞外多聚物由多糖、蛋白質及胞外DNA(eDNA)組成。簡單的說，細菌生物被膜主要包括被包裹的細菌和細菌自身分泌的胞外基質。生物被膜的形成猶如給被包裹著的細菌添加了一層屏障，因此生物被膜的形成可以顯著增強細菌耐受不利環(huán)境的能力。有研究報道，成熟生物被膜包裹的細菌對抗菌藥物的敏感性為浮游狀態(tài)的細菌的1/10-1/1000，耐熱

2、性也相應增加，對環(huán)境變化不敏感[1]。因此生物被膜的形成是細菌抵御外界不利環(huán)境的一種重要形式，也是造成臨床感染難以治療的重要因素之一。形成生物被膜的細菌主要有銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。
　　金黃色葡萄球菌，俗稱金葡菌，呈圓形或卵圓形，革蘭染色陽性，是一種重要的病原

3、菌。金葡菌能引起皮膚軟組織感染、肺炎、感染性心內膜炎、骨髓炎以及食物中毒等。隨著抗生素的廣泛使用，金葡菌的耐藥性變得愈發(fā)嚴峻[2，3]，例如耐甲氧西林的金葡菌MRSA，中介耐萬古霉素的金葡菌VISA，耐萬古霉素的金葡菌VRSA等的出現和流行，給臨床抗感染治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將MRSA/VISA列為高度優(yōu)先迫切需要開發(fā)抗菌藥物的12種“超級細菌”之一。生物被膜的形成是金葡菌產生耐藥性的重要原因。盡管金葡菌生物被膜形

4、成的調控網絡十分復雜，但根據胞外基質組分可將金葡菌生物被膜的調控途徑分為三條，分別是多糖合成途徑、蛋白質合成途徑，以及eDNA合成途徑。
　　本課題組前期從我校某附屬醫(yī)院一膿毒癥患者體內分離獲得一株金葡菌，命名為XQ株。在體外連續(xù)培養(yǎng)時，獲得一株顏色變白的新菌株，命名為XQW株。由于XQW株在液體培養(yǎng)基中呈絮狀生長，推測其生物被膜形成能力可能有所增強。為了證實該假設，我們采用結晶紫染色法和激光共聚焦顯微鏡檢測并比較了XQ株與XQW

5、株的生物被膜形成差異;通過全基因組測序，發(fā)現XQW株存在SigB(Q225P)突變;利用基因位點替換和回補菌株驗證了SigB(Q225P)突變在金葡菌生物被膜形成中的作用。隨后，利用RT-qPCR檢測比較XQ株與XQW株生物被膜形成相關基因表達差異，發(fā)現耐熱核酸酶基因nuc在XQW株中表達顯著下降，可能影響金葡菌生物被膜形成，進一步通過lacZ報告系統(tǒng)和EMSA初步探討了SigB(Q225P)調控金葡菌生物被膜形成的機制。主要內容和結果

6、如下:
　　1.SigB(Q225P)突變促進金葡菌生物被膜形成的作用研究
　　(1) XQ株與XQW株的生物被膜形成能力比較。
　　①從體外傳代中獲得的菌落顏色變白的XQW株在液體培養(yǎng)基中呈絮狀生長，我們首先通過結晶紫染色法比較了XQ株與XQW株的生物被膜形成能力。結果表明，與XQ野生型相比，XQW株的生物被膜形成能力明顯增強。
　　②通過激光共聚焦顯微鏡觀察XQ株與XQW株所形成的生物被膜，結果顯示XQW株的

7、生物被膜較XQ株厚而致密，表明XQW株的生物被膜形成能力較XQ株強。
　　(2) SigB(Q225P)突變可能是XQW株生物被膜形成增強的重要原因
　　①為探索XQW生物被膜形成增強的原因，我們對XQ株和XQW株進行了全基因組測序（XQ株基因組GenBank登錄號:CP013137）?；蚪M比較發(fā)現，與XQ相比，XQW株的基因組DNA發(fā)生了527處點突變，其中392處突變導致了相應基因編碼的氨基酸發(fā)生改變，可能影響161個

8、基因的功能。根據XQW株顏色變白及生物被膜形成增強的表型，我們進一步利用BLAST比較了與金葡菌色素合成相關及與生物被膜形成有關的基因，結果發(fā)現XQW的sigB發(fā)生了點突變，該基因的第674位堿基由A突變?yōu)镃，使得SigB蛋白第225位谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?Q225P)。
　　②sifB在金葡菌中的作用。已有文獻報道，sigB基因在金葡菌中除了調控色素的合成之外，還具有調控毒力因子表達，促進生物被膜形成以及調節(jié)耐藥性等多種生物學功

9、能。通常，一個基因的突變可使該基因的功能喪失。據文獻報道，sigB基因缺失株的生物被膜形成能力下降。然而，我們檢測到的SigB(Q225P)是一種新發(fā)現的sigB突變，該突變可能使XQW株生物被膜的形成能力增強，這引起了我們深入探索SigB(Q225P)突變促進金葡菌生物被膜形成機制的興趣。這一新的突變類型反而導致生物被膜形成能力增強。接下來我們希望探究SigB(Q225P)突變如何促進金葡菌生物被膜形成的機制。同時也可進一步檢測Sig

10、B(Q225P)在不同的金葡菌中是否均能促進生物被膜的形成。
　　(3) SigB(Q225P)促進金葡菌生物被膜的形成
　　因XQ株為臨床金葡菌分離株，遺傳操作難以進行。為深入探究SigB(Q225P)突變在促進金葡菌生物被膜形成中的作用，我們利用金葡菌Newman進行遺傳操作，構建相關突變菌株和回補菌株，檢測它們的生物被膜形成差異，驗證SigB(Q225P)突變在促進金葡菌生物被膜形成中的作用。
　?、倩蛱鎿Q突變

11、株Newman-sigB(Q225P)的構建。分別以XQW株、Newman株
　　基因組為模板，擴增sigB上游及sigB(Q225P)序列，依次克隆到大腸埃希菌-金葡菌穿梭質粒pBT2中，構建pBT2-sigB(Q225P)。通過電轉化將pBT2-sigB(Q225P)轉入金葡菌RN4220中，并通過PCR和酶切進行驗證。接著將經過RN4220修飾后的pBT2-sigB(Q225P)電轉入金葡菌Newman中，根據pBT2對溫度

12、敏感的特性，我們篩選出疑似的Newman-sigB(Q225P)，最后通過測序進行鑒定。測序結果顯示基因替換突變株Newman-sigB(Q225P)構建成功。
　?、诨蚯贸闚ewman-△sigB的構建。以金葡菌Newman基因組為模板擴增sigB基因的上下游片段，依次將上下游片段克隆到pBT2中，獲得pBT2-△sigB。再將pBT2-△sigB轉化Newman，篩選獲得Newman-△sigB。
　?、刍匮a菌株Ne

13、wman-△sigB/sigB的構建。以金葡菌Newman基因組為模板分別擴增sigB-promoter、sigB序列，依次將片段克隆到大腸埃希菌-金葡菌穿梭質粒pLI50中，構建pLI50-sigB重組表達質粒。通過電轉化將pLI50-sigB重組質粒轉入金葡菌Newman-△sigB中，通過Western blot驗證pLI50-sigB在Newman-△sigB中表達相應的SigB。
　　④回補菌株Newman-△sigB/

14、sigB(Q225P)的構建。分別以Newman、XQW基因組為模板擴增sigB-promoter、sigB(Q225P)，依次將片段克隆到大腸埃希菌-金葡菌穿梭質粒pLI50中，構建pLI50-sigB(Q225P)。轉化并獲得回補菌株Newman-△sigB/sigB(Q225P)。
　?、萆锉荒ば纬赡芰z測。對Newman、Newman-sigB(Q225P)、Newman-△sigB/sigB、Newman-△sigB/

15、sigB(Q225P)等菌株的生物被膜形成能力進行檢測和比較。結晶紫染色法結果表明Newman-sigB(Q225P)基因替換突變株的生物被膜形成能力明顯強于Newman野生型，該結果與在XQW株中的發(fā)現相一致。并且Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力強于Newman-△sigB/sigB。激光共聚焦顯微鏡檢測也證實N ewman-sigB(Q225P)的生物被膜形成能力較Newman野生型厚而致密。這些結

16、果表明，sigB(Q225P)突變具有促進金葡菌生物被膜形成的作用。
　　2.SigB(Q225P)促進金葡菌生物被膜形成的機制探討
　　(1)RT-qPCR檢測并篩選XQW株生物被膜形成增強的相關基因。根據金葡菌胞外基質組分可將金葡菌的生物被膜調控網絡分為三條途徑，即胞外多糖合成途徑、蛋白質合成途徑，和eDNA合成途徑。我們根據這三條途徑篩選了nuc、fnbA、fnbB、clfA、icaA基因作為檢測靶標。結果表明，與XQ

17、株相比，XQW株的耐熱核酸酶編碼基因nuc的表達水平顯著下降。作為降解生物被膜中主要成分eDNA的功能酶，nuc表達降低將促進eDNA的積累，有利于生物被膜形成。
　　(2)SigB(Q225P)間接調控nuc基因的表達水平。為探索Sig(Q225P)下調nuc表達的分子機制，我們構建了nuc基因啟動子控制的LacZ報告質粒，分別轉化Newman和Newman-sigB(Q225P)，LacZ活性檢測結果顯示nuc啟動子在Newm

18、an-sigB(Q225P)中的活性較Newman野生株明顯下降，表明SigB(Q225P)突變確實能影響nuc的表達。然而，進一步利用重組表達的SigB和SigB(Q225P)蛋白進行EMSA實驗，結果并未顯示SigB或SigB(Q225P)蛋白能與nuc啟動子區(qū)直接結合。因此，我們推測SigB(Q225P)對nuc基因的表達調控是間接的。
　　3.結論:SigB(Q225P)突變通過間接下調nuc表達水平從而促進金黃色葡萄球菌