過表達(dá)Cx43的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心梗后心衰的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因和大鼠縫隙連接蛋白43基因（Cx43）的重組慢病毒，并進行包裝、純化。
　　 方法：用RT-PCR 技術(shù)獲得大鼠的Cx43基因，并將其連接到含有EGFP基因的慢病毒表達(dá)載體pGC-FU中，重組獲得慢病毒載體質(zhì)粒pGC-FU-Cx43，采用限制性內(nèi)切酶酶切法和DNA 測序鑒定構(gòu)建的載體是否正確。將pGC-FU-Cx43與輔助包裝質(zhì)粒載體（pHelper1.0、

2、pHelper2.0）一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)病毒并測定其滴度。
　　 結(jié)果：酶切證實目的基因Cx43 已經(jīng)定向連入目的載體，測序結(jié)果顯示，所構(gòu)建的pGC-FU-Cx43 重組慢病毒質(zhì)粒序列與目標(biāo)序列完全一致。最終獲得的病毒滴度為2x109 TU/ml。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建并包裝獲得較高滴度的含有EGFP基因和目的基因Cx43的重組慢病毒pGC-FU-Cx43，為后續(xù)的體外及在體研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第

3、二部分
　　 目的：分離、培養(yǎng)、擴增大鼠BMSC，并轉(zhuǎn)染重組慢病毒pGC-FU-Cx43，觀察BMSC中Cx43的表達(dá)及細(xì)胞間通訊功能的變化。
　　 方法：用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化培養(yǎng)大鼠BMSCs，選取P3代細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)記。重組慢病毒pGC-FU-Cx43 轉(zhuǎn)染P3代細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)，以Western blot 法檢測轉(zhuǎn)染后BMSC中Cx43的蛋白含量，以熒光漂白恢復(fù)

4、技術(shù)（FRAP）檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞間通訊功能的變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)分離、純化得到細(xì)胞純度較高的BMSC；pGC-FU-Cx43 轉(zhuǎn)染BMSC后，可見大量EGFP表達(dá)，目的蛋白Cx43的表達(dá)量明顯增加，且細(xì)胞間通訊功能增強。
　　 結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法可以有效地分離純化BMSC。重組慢病毒pGC-FU-Cx43 成功轉(zhuǎn)染BMSC，目的蛋白的表達(dá)增加且細(xì)胞間通訊功能增強。
　　 第三部分
　　 目

5、的：建立大鼠心肌梗死模型，觀察移植過表達(dá)Cx43的BMSC對心梗后心衰的治療作用。
　　 方法：120只SD大鼠隨機分為四組，Sham組：假手術(shù)組，n=30；DMEM/F12組，注射DMEM/F12，n=30；EGFP組：移植轉(zhuǎn)染EGFP基因的BMSC, n=30；Cx43組：移植轉(zhuǎn)染Cx43基因的BMSC，n=30。采用結(jié)扎前降支的方法，建立心肌梗死模型，于梗死后30min，行細(xì)胞移植。移植后四周，超聲心動圖檢測心臟功能并取心

6、臟組織檢測各項指標(biāo)。在Langendorff 離體心臟灌注系統(tǒng)下行心臟電生理檢查，誘發(fā)心動過速。
　　 結(jié)果：與DMEM/F12組相比，EGFP組和Cx43組心功能明顯改善，心肌梗死面積縮小，膠原纖維含量降低。尤以Cx43組上述心臟重構(gòu)指標(biāo)改善更明顯。RT-PCR和Western blot 顯示DMEM/F12和EGFP組大鼠心肌組織Cx43表達(dá)明顯降低；移植Cx43 轉(zhuǎn)染BMSC后，Cx43表達(dá)量增加。激光共聚焦顯示EGFP組

7、和Cx43組有BMSC存活，并可見BMSC與宿主心肌組織間有縫隙連接形成。電生理檢查顯示，DMEM/F12組室性心律失常的誘發(fā)率明顯增高，EGFP組的心律失常的誘發(fā)率與DMEM/F12組無明顯差異，Cx43組的心律失常誘發(fā)率較DMEM/F12組和EGFP組明顯降低。
　　 結(jié)論：同種異體BMSC 移植延緩心室重塑，改善心臟功能，且對可誘導(dǎo)的心律失常無明顯影響；過表達(dá)Cx43的BMSC 移植改善心肌梗死后心衰的效果更為明顯，且可以