無血清和缺氧誘導骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡及凋亡機制的研究.pdf

1、心肌缺血后誘發(fā)的心肌細胞丟失以及內(nèi)源性修復(fù)機制的缺乏是心力衰竭進程中的關(guān)鍵誘導因素?？刂菩氖抑厮艿陌l(fā)展從而逆轉(zhuǎn)心衰的進程是醫(yī)學上急需解決的問題。 骨髓間充質(zhì)干細胞移植因其可以有效地替換缺血后丟失的心肌細胞，改善心臟功能，而成為治療心肌缺血的新的希望。然而惡劣的缺血心臟微環(huán)境誘導移植細胞的大量丟失和細胞凋亡限制了細胞移植的治療效果。缺血環(huán)境中誘導骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的關(guān)鍵因素以及細胞凋亡的詳盡的細胞信號機制尚不清楚。 本研

2、究從人胸骨骨髓以及大鼠腿骨骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細胞，以無血清和缺氧處理模擬體內(nèi)養(yǎng)分匱乏和低氧的缺血微環(huán)境，證實缺血可以誘導移植細胞的凋亡；比較系統(tǒng)地研究了該細胞凋亡的線粒體凋亡信號傳導機制。另外，初步探討了線粒體的上游途徑，即細胞線粒體如何感受細胞外刺激的可能的信號機制。本論文旨在闡明缺血誘導骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的細胞、分子機制，為細胞移植在臨床的應(yīng)用和研究提供新的突破口。 本研究主要包括以下的內(nèi)容：1、以percoll密度

3、梯度離心法從人的胸骨骨髓中分離人骨髓間充質(zhì)干細胞，以直接貼壁法從大鼠腿骨骨髓中分離出鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。利用流式細胞術(shù)證實所分離的細胞以及傳代后的細胞其表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45的分布與文獻中所描述間充質(zhì)干細胞的特征相一致。對所分離的細胞進行成骨細胞誘導和成脂肪細胞誘導，證明所得到的細胞具有多向分化潛能。由以上的證據(jù)證實所獲得的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。 2、利用體內(nèi)缺血的兩個主要的生理特征：生長因子匱乏和缺氧

4、，建立了骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的無血清和缺氧聯(lián)合處理的體外模擬缺血模型。用Hoechst33342熒光核染色、流式細胞術(shù)分析細胞大小變化和Annexin-ⅤFITC標記等方法在該模型上證實缺血誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡現(xiàn)象?；瘜W生色底物法檢測到細胞凋亡后細胞Caspase-3、8、9的活性變化以及Westernblotting檢測到Caspase-3前體的酶解等凋亡相關(guān)事件。Caspase廣譜性抑制劑zVAD-fmk能夠完全抑制細胞的

5、凋亡，證明骨髓間充質(zhì)干細胞的凋亡依賴于Caspase信號途徑。Annexin-ⅤFITC標記流式細胞術(shù)分析以及Caspase-3前體的酶解的結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細胞對無血清刺激較缺氧刺激更為敏感，提示缺血心肌的相關(guān)生長因子的匱乏對移植細胞生存有重要影響。 3、首次進行了無血清和缺氧誘導下骨髓間充質(zhì)干細胞線粒體凋亡信號途徑的研究。激光共聚焦、Westernblotting、流式細胞術(shù)和化學生色底物法分別證實缺血誘導了骨髓間充質(zhì)干細

6、胞線粒體膜電位的下降、細胞色素C的釋放以及細胞Caspase-9的激活等凋亡相關(guān)事件。線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔PTP的抑制劑環(huán)胞菌素A(CsA)能夠完全抑制該細胞凋亡，說明無血清和缺氧誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞線粒體PTP依賴的凋亡途徑。Bcl-2家族蛋白Bax在細胞凋亡過程中由骨髓間充質(zhì)干細胞胞漿聚集到線粒體外膜，可能參與調(diào)控細胞凋亡線粒體信號傳遞。正常培養(yǎng)和凋亡的骨髓間充質(zhì)干細胞的p53蛋白15號位絲氨酸均有較高水平的磷酸化，提示無血清和缺氧

7、誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡是p53蛋白非依賴的。 4、首次探討了Caspase-8在無血清和缺氧誘導的細胞凋亡中的作用。盡管Westernblotting和化學生色底物法分別驗證了細胞凋亡過程中死亡受體Fas及其配體Fas-L表達量的上升、Caspase-8活性的上升等反應(yīng)死亡受體激活的凋亡相關(guān)事件，但用Caspase-8特異性抑制劑zIETD-fmk完全抑制Caspase-8的酶活性后卻不能抑制細胞的凋亡，提示無血清和缺氧誘導

8、的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡是Caspase-8非依賴的。 5、初步研究了MAPK信號途徑在無血清和缺氧誘導的細胞凋亡中的作用。Westernblotting檢測蛋白磷酸化水平的變化，以信號通路阻斷劑檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果顯示p38信號途徑部分參與了缺血誘導的細胞凋亡信號的傳遞；ERK1/2信號途徑參與了細胞對缺血刺激的應(yīng)答，卻沒有參與細胞凋亡信號的傳遞；JNK在正常培養(yǎng)的細胞中就有較高水平的磷酸化，沒有參與細胞的凋亡過程。提示在細

9、胞外刺激向線粒體傳遞凋亡信號過程中，即線粒體的上游途徑可能與p38信號通路有關(guān)。 綜上所述，本文確認了無血清和缺氧誘導移植的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的現(xiàn)象，首次詳盡地描繪了無血清和缺氧刺激后細胞細胞凋亡的動態(tài)變化；首次系統(tǒng)地研究了線粒體依賴的Caspase信號途徑在骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡中的重要作用，提出線粒體功能損傷在該細胞凋亡過程中的中心地位，為尋找抑制骨髓間充質(zhì)干細胞移植后凋亡的手段提供了潛在的靶點；初步探討了細胞外刺激向該細胞