基于可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型方法的結(jié)核分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的：初步探討15個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(Variable Number Tandem Repeat，VNTR)位點(diǎn)在天津地區(qū)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)中的多態(tài)性、天津地區(qū)的主要流行菌株以及VNTR分型方法在結(jié)核分子流行病學(xué)中的主要應(yīng)用。 方法：選取天津市結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室菌種庫中2005年6月至2006年4月的100株MTB，收集這100例確診肺結(jié)核患者的一般資料和實(shí)驗(yàn)室資料

2、。將菌株復(fù)蘇傳代，提取其基因組DNA。采用PCR方法擴(kuò)增結(jié)核菌基因組中的15個(gè)VNTR位點(diǎn)，包括由12個(gè)結(jié)核分枝桿菌散在重復(fù)單元(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit，MIRU)和5個(gè)精確串聯(lián)重復(fù)序列(Exact Tandem Repeats，ETR)(其中的兩個(gè)與MIRU位點(diǎn)一致)。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物并通過Quantity One4

3、.4分析軟件確定PCR產(chǎn)物的片段長度并與標(biāo)準(zhǔn)菌株H<,37>Rv比較計(jì)算得到每個(gè)菌株不同串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)的拷貝數(shù)，將部分菌株的VNTR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序；評(píng)價(jià)每個(gè)VNTR位點(diǎn)的多態(tài)性以及MIRU位點(diǎn)和ETR位點(diǎn)對(duì)天津地區(qū)結(jié)核菌株的綜合分辨能力。應(yīng)用PAUP4.0軟件繪制系統(tǒng)樹圖，揭示菌株之間的相互關(guān)系。根據(jù)VNTR基因分型結(jié)果，設(shè)計(jì)調(diào)查表，收集成簇菌株的患者資料，用以追蹤同一簇患者問的相互傳播途徑。應(yīng)用SPSS11.5進(jìn)行卡

4、方檢驗(yàn)和單因素Logistic回歸分析。 結(jié)果： 1、基本資料描述：本次研究中的100株MTB分別來自100名肺結(jié)核患者，患者的男女比例為1.9：1，年齡的中位數(shù)為36歲(15-82歲)，以20-29歲患者比例最高。市內(nèi)六區(qū)患者占患者總數(shù)的81％，初治患者占81％，有卡介苗接種史的患者占68％。 2、本次研究中58株MTB的5個(gè)ETR-VNTR位點(diǎn)拷貝數(shù)編碼均為42435，另有兩株編碼分別為42436和42433

5、，均屬于具有北京家族VNTR分型特點(diǎn)的菌株，共占實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)的60％。 3、5個(gè)ETR-VNTR位點(diǎn)僅將菌株分為23個(gè)基因型，獨(dú)立株17株，6個(gè)簇，最大簇包含58株菌；12個(gè)MIRU-VNTR位點(diǎn)將菌株分為45個(gè)基因型，獨(dú)立株36株，9個(gè)簇，最大簇包含34株菌；MIRU和ETR-VNTR相結(jié)合后將菌株可被分為52個(gè)基因型，獨(dú)立株4l株，11個(gè)簇，最大簇包含29株菌。成簇組與非成簇組患者在性別，年齡，住址，治療史，卡介苗接種史等方

6、面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4、VNTR位點(diǎn)等位基因多樣性(h)分析結(jié)果顯示：MIRU-26和MIRU-31位點(diǎn)多態(tài)性較好h分別為0.54和0.45；其次為MIRU-10，40和ETR-A，0.3

7、比較結(jié)果顯示：單獨(dú)使用5個(gè)ETR位點(diǎn)、12個(gè)MIRU位點(diǎn)和兩者結(jié)合后分辨能力HGDI分別為0.6503，0.8622和0.9093。 5、PAUP分析表明，100株MTB可被分為三組(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)，其中89株菌屬于第Ⅲ組，屬于Ⅰ，Ⅱ兩組的菌株分別為6株和5株。 6、對(duì)成簇組的結(jié)核病患者資料進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其中2名患者為相繼發(fā)病的某中學(xué)同班同學(xué)，可以確定這兩名患者處于同一條傳播鏈上。 結(jié)論：15個(gè)VNTR位點(diǎn)中MI