不結(jié)球白菜冷相關(guān)CBF基因的鑒定及調(diào)控路徑.pdf

1、白菜類作物原產(chǎn)我國(guó)，栽培歷史悠久且品種豐富。在植物學(xué)分類上，白菜類作物隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，主要包括大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）、不結(jié)球白菜（Brassica rapa ssp.chinensis）和蕪菁（Brassica rapa ssp.rapa）。其中，不結(jié)球白菜是我國(guó)長(zhǎng)江中下游廣泛種植的大眾蔬菜。與擬南芥一樣，不結(jié)球白菜也通過一系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制來誘

2、發(fā)冷馴化，從而提高其耐寒性，而由CBF轉(zhuǎn)錄因子家族基因主導(dǎo)的CBF冷響應(yīng)通路是這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中最重要的組成之一。因而系統(tǒng)的研究CBF冷響應(yīng)通路對(duì)于更好的認(rèn)識(shí)不結(jié)球白菜的抗寒甚至其他環(huán)境脅迫的調(diào)控機(jī)制非常重要。本研究分離和克隆了不結(jié)球白菜的CBF基因，分析其脅迫表達(dá)模式及調(diào)控特點(diǎn)，并進(jìn)一步研究上游Bc WRKY33對(duì)BcCBF3基因的調(diào)控關(guān)系;通過小RNA測(cè)序技術(shù)挖掘CBF在關(guān)聯(lián)不結(jié)球白菜的抗寒和病原響應(yīng)機(jī)制中的作用;此外，對(duì)近緣亞種大

3、白菜進(jìn)行MYB轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定分析，并以此作為對(duì)不結(jié)球白菜及整個(gè)白菜類作物CBF基因上游調(diào)控因子MYB的研究的參考。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.從不結(jié)球白菜品種‘蘇州青’中分離得到8個(gè)CBF同源基因，其編碼的BcCBF蛋白與擬南芥中的同源蛋白相似性較高。實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析表明，BcCBF1～3被冷脅迫(4℃)而非干旱或脫落酸(ABA)誘導(dǎo)，它們參與了ABA-獨(dú)立路徑;而BcCBF4～6的表達(dá)受到干旱和ABA調(diào)

4、控，它們參與ABA-依賴路徑。與擬南芥的同源基因不同，BcCBF4～6表現(xiàn)出的低溫和ABA響應(yīng)，暗示在不結(jié)球白菜中，CBF通路的ABA依賴路徑和ABA獨(dú)立路徑并不是完全分開的，而這些基因可能作為兩者的聯(lián)系點(diǎn)。
　　2.利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了4個(gè)不結(jié)球白菜BcCBF基因的過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明這四個(gè)BcCBF蛋白都定位在細(xì)胞核中。用含有BcCB F3-pEarleyGate103的農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)

5、化擬南芥;通過酶切連接獲得BcCBF3的甘藍(lán)縮葉病毒(Cblcv)誘導(dǎo)的基因沉默載體BcCBF3-PCVA并得到不結(jié)球白菜的瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。在擬南芥中，AtCBF2受到BcCBF3過表達(dá)顯著抑制，而實(shí)時(shí)定量分析表明BcCBF2的表達(dá)與BcCBF3無直接關(guān)系。其上游的BcMYB15則受BcCBF表達(dá)量的反饋抑制，下游BcCOR15A表達(dá)與BcCBF3正相關(guān)并放大其表達(dá)的變化。
　　3.對(duì)BcCBF3的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，鑒定出兩

6、個(gè)WRKY結(jié)合順式元件W-box。鹽處理表達(dá)模式及煙草的GUS染色結(jié)果表明兩個(gè)W-box對(duì)于WRKY的結(jié)合都有作用。進(jìn)一步對(duì)Bc WRKY33的過量表達(dá)不結(jié)球白菜中CBF相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明BcWRKY33的組成型表達(dá)激活了BcCBF3的轉(zhuǎn)錄，而在低溫下它們的表達(dá)變化都要大于未處理時(shí)。BcCBF4在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)模式表明雖然它與WRKY33都響應(yīng)ABA，但彼此對(duì)ABA的響應(yīng)機(jī)制是獨(dú)立的。此外，BcWRKY33的原核表達(dá)獲得

7、了BcWRKY33-GST重組蛋白，為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白-DNA互作打下基礎(chǔ)。
　　4.以感染蕪菁花葉病毒和健康的葉子為材料進(jìn)行小RNA測(cè)序，測(cè)序挖掘出86個(gè)保守和45個(gè)新的的miRNA。其中，共69個(gè)miRNA響應(yīng)TuMV侵染，包括42個(gè)下調(diào)和27個(gè)上調(diào)miRNA。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的共有271個(gè)靶基因，這些基因主要參與發(fā)育調(diào)控和脅迫響應(yīng)。選擇了13個(gè)miRNA及其相應(yīng)的靶基因，探索其在TuMV或冷脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，一些

8、TuMV響應(yīng)的miRNA也被低溫誘導(dǎo)，其可能作為兩種脅迫響應(yīng)機(jī)制的聯(lián)結(jié)。
　　5.對(duì)白菜類作物CBF基因的啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其都含有MYB結(jié)合元件，表明MYB轉(zhuǎn)錄因子在白菜類作物CBF上游調(diào)控中具有普遍性作用。隨后，從大白菜中鑒定出了256個(gè)R2R3-MYB基因，通過進(jìn)化樹分析將大白菜中的273個(gè)R2R3-、3R-和非典型的MYB蛋白分成45個(gè)亞組。RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析則反映了R2R3-B