不結(jié)球白菜抗壞血酸合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)及BcPMI2的功能分析.pdf

1、抗壞血酸(AsA)，叉稱維生素C，是動(dòng)植物體內(nèi)維持生命所必需的一種物質(zhì)。植物的AsA含量由AsA合成和消耗的速率共同決定。高等植物中AsA合成的主要途徑是L-半乳糖途徑，L-半乳糖途徑包括8個(gè)典型的生理生化反應(yīng)，也就對(duì)應(yīng)著8個(gè)催化這些反應(yīng)的酶，植物通過(guò)調(diào)節(jié)編碼這些酶的基因的表達(dá)量改變細(xì)胞內(nèi)這些酶的總活力，從而調(diào)節(jié)AsA的合成速率和AsA的積累。通過(guò)外界或人為地改變一些酶的活力同樣可能影響到植物AsA的積累。
　　 ⑴測(cè)量經(jīng)過(guò)高p

2、H值處理的植物樣品提取液與未經(jīng)過(guò)高pH值處理的提取液在245nm下吸光值的差值，可以計(jì)算植物樣品提取液中的還原型AsA的濃度。本研究針對(duì)該方法比較了不同的方法降解AsA的效果。最后應(yīng)用該方法測(cè)定不結(jié)球白菜樣品的AsA含量，并與紅菲羅啉法測(cè)定AsA的結(jié)果進(jìn)行比較，兩種方法對(duì)于不同樣品的AsA含量高低關(guān)系基本一致。本方法加標(biāo)回收率在90％以上，同品種的測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在2％-12％之間。
　　 ⑵在貯藏過(guò)程中采用二氧化碳?xì)怏w(CO

3、2)處理采后不結(jié)球白菜，減緩了AsA含量的下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其他活性物質(zhì)，包括可溶性蛋白和葉綠素的損失都可被CO2抑制；CO2處理可抑制過(guò)氧化氫清除酶系統(tǒng)中的過(guò)氧化氫酶(CAT)，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和過(guò)氧化物酶(POD)活力的升高，說(shuō)明高濃度CO2可以降低植物衰老過(guò)程中活性氧脅迫的影響，從而減少AsA等活性物質(zhì)的消耗。50％和100％的CO2處理都可延緩采后不結(jié)球白菜貯藏過(guò)程中AsA含量的下降，而前者的處理效果要優(yōu)于后者.在室溫下

4、(25℃)CO2處理對(duì)AsA的保持效果較明顯，4℃下CO2處理的效果沒(méi)有明顯優(yōu)于空氣處理；在CO2處理的條件下，不同溫度處理對(duì)AsA的改變也不明顯。
　　 ⑶L-半乳糖途徑各個(gè)基因的表達(dá)量對(duì)AsA積累有決定性的作用。本研究克隆了7個(gè)L-半乳糖途徑的相關(guān)基因，采用實(shí)時(shí)定量PCR的手段分析了L-半乳糖途徑的各個(gè)基因在AsA含量不同的品種中的表達(dá)差異。結(jié)果表明不結(jié)球白菜品種‘烏塌菜’的AsA含量較高并不是因?yàn)長(zhǎng)-半乳糖途徑中某個(gè)基因的

5、表達(dá)量較高。5 mM的茉莉酸甲酯可以短暫地提高AsA含量。L-半乳糖途徑中8個(gè)基因，除了BcVTC4，其余的基因均明顯受到茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)上調(diào)。BcVTC1，BcGME，BcVTC2和BcGLDH4個(gè)基因在茉莉酸甲酯處理后的3 h即表現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)，這4個(gè)基因可能就是茉莉酸信號(hào)誘導(dǎo)AsA積累的幾個(gè)調(diào)控的靶基因。
　　 ⑷PMI是L-半乳糖途徑第一步反應(yīng)的催化酶。本研究用轉(zhuǎn)基因手段將不結(jié)球白菜中編碼PMI的基因BcPMI在煙草中過(guò)量

6、表達(dá)，經(jīng)過(guò)GUS組織化學(xué)染色，PCR鑒定得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株8株；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，選取目的基因正常表達(dá)的P1和P2兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行后續(xù)研究。結(jié)果表明BcPMI2在煙草中的過(guò)量表達(dá)不僅沒(méi)有提高煙草葉片的AsA含量，反而使正常生長(zhǎng)狀態(tài)的煙草的葉片AsA含量降低，同時(shí)使葉片的可溶性糖含量降低。但BcPMI2在煙草中的過(guò)量表達(dá)提高了其葉片的過(guò)氧化氫耐受能力；轉(zhuǎn)基因煙草的葉盤經(jīng)過(guò)低濃度的過(guò)氧化氫處理3 d，其AsA的含量高于同樣條件處理的野