不結(jié)球白菜對棉疫病菌非寄主抗性相關基因的篩選和功能分析.pdf

1、本研究就不結(jié)球白菜對棉疫病菌非寄主抗性相關基因的篩選和其中一個過敏性細胞死亡過程中上調(diào)表達的基因BcLCB2的功能進行了研究。 采用抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)的方法篩選疫霉菌激發(fā)子PB90注射處理不結(jié)球白菜葉片5 h內(nèi)上調(diào)表達的基因。激發(fā)子PB90從棉疫病菌Phytophthora boehmeriae中獲得。測定分析了200個PB90誘導不結(jié)球白菜過敏性

2、細胞死亡早期上調(diào)表達的cDNA片段,生物信息學分析表明它們包含70個上調(diào)表達的基因,共分為9類：基本能量或代謝生產(chǎn)；蛋白質(zhì)合成分解；細胞信號傳導機制；細胞凋亡；轉(zhuǎn)錄；細胞運輸和編碼未知功能的蛋白等。進一步采用半定量RT-PCR分析了候選基因beclin,thioredoxin,HLA-B,MAP3K,SPT1,SPT2和AGO1,表明這7個基因在PB90誘導不結(jié)球白菜過敏性細胞死亡早期上調(diào)表達。構(gòu)建了疫霉菌激發(fā)子PB90誘導不結(jié)球白菜過

3、敏性細胞死亡早期抑制性差減雜交cDNA文庫,鑒定了70個上調(diào)表達的基因,并對其中7個基因的可能功能進行預測分析,這些基因的挖掘為進一步闡明過敏性細胞死亡的分子機制提供了素材。 本文采用RACE從Phytophora boehmeriae激發(fā)子PB90誘發(fā)不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)早期過敏反應上調(diào)表達的基因中獲得一個的編碼絲氨酸棕櫚轉(zhuǎn)移酶亞基的基因BcLCB2,該基因在花和莖中

4、的表達量比葉和根高。采用農(nóng)桿菌介導的瞬時過量表達法證明BcLCB2在煙草葉片中過量表達可抑制PB90、elicitin、MgNep1(來源于稻瘟菌)、hrf1xoo(來源于水稻白葉枯病菌)等4種激發(fā)子和動物促凋亡蛋白Bax誘導的煙草過敏反應。DAB染色結(jié)果表明BcLCB2過量表達時,H2O2累積量減少。進一步以激發(fā)子處理通過病毒誘導基因沉默技術沉默了NbLCB2的本氏煙葉片,發(fā)現(xiàn)該基因的沉默加快了激發(fā)子誘導的過敏反應。本文還觀察到在煙草

5、與青枯菌(Ralstonia solanacearum)親和互作中,BcLCB2的過量表達明顯抑制了病斑的擴展。BcLCB2也可抑制Bax引起的酵母細胞凋亡和抑制凋亡時活性氧的積累；BcLCB2在酵母中表達還可提高酵母細胞對氧化劑的耐受性。上述結(jié)果表明BcLCB2是激發(fā)子誘發(fā)的煙草過敏性細胞死亡和親和互作中的細胞死亡及Bax誘發(fā)酵母細胞凋亡的一個負調(diào)控因子,可能通過抑制活性氧的積累來抑制細胞死亡；同時結(jié)果還提示植物的過敏性細胞死亡和酵母