人乳頭瘤病毒58型的基因變異,病毒載量及整合狀態(tài)與宮頸病變的相關(guān)性研究.pdf

1、高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是引起宮頸癌(cervicalcancer，CC)發(fā)生的重要因素。在女性生殖道中約發(fā)現(xiàn)超過40種人乳頭瘤病毒，其中15種為與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的高危型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73和82)。HPV16和HPV18是最常見的與宮頸癌相關(guān)的型別，而非HPV16/18型在宮頸細(xì)胞內(nèi)瘤樣變（cervical intrae

2、pithelial neoplasia，CIN）的分布有著顯著的地域性差異。我們的前期研究顯示HPV58型占中國東北地區(qū)宮頸癌患者第二位，感染率為7.79％。然而，并非所有高危型HPV感染都會(huì)最終進(jìn)展為惡性病變，一般認(rèn)為長期持續(xù)的HPV感染會(huì)導(dǎo)致患者從CIN逐步進(jìn)展為宮頸癌，同時(shí)有研究顯示某些特異的型內(nèi)變異可能會(huì)影響HPV的持續(xù)感染而最終導(dǎo)致癌前病變轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y。
　　 HPV的潛在致癌性主要與E6和E7兩個(gè)致癌蛋白有關(guān)。HPV

3、E6和E7蛋白分別通過使腫瘤抑制因子P53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein， pRb)功能失活而控制細(xì)胞周期和凋亡。L1蛋白是HPV主要的衣殼蛋白，能夠自己裝配成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)從而誘導(dǎo)高水平的中和抗體產(chǎn)生并在動(dòng)物感染動(dòng)物乳頭瘤病毒后的模型中顯示出很高的保護(hù)性。由于氨基酸序列的替換可能會(huì)影響L1蛋白的結(jié)構(gòu)、功能或抗原特性，所以研究L1區(qū)域的改變將對定義設(shè)計(jì)

4、疫苗和診斷藥物的相關(guān)表位有重要意義。HPV長控制區(qū)(long control region，LCR)包含DNA復(fù)制起始，增強(qiáng)元件和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列，是主要的病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。LCR通過與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，調(diào)節(jié)早期區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄。目前，國際上關(guān)于HPV基因變異導(dǎo)致宮頸病變的研究主要集中在HPV16和HPV18型，關(guān)于HPV58變異情況的研究數(shù)據(jù)很少。
　　 高危型HPVs持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素，多階段，長時(shí)間的累積過程，約

5、80％的女性在其一生中會(huì)感染HPV，而最終僅一小部分患者會(huì)發(fā)展為宮頸癌。因此，除了病毒自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)外，感染病毒載量及病毒整合情況等可能都對宮頸癌的發(fā)生有影響，病毒載量可能為一個(gè)早期檢查或預(yù)測高度宮頸病變和宮頸癌的一個(gè)標(biāo)志物。最近的研究數(shù)據(jù)顯示高危型病毒載量與高度鱗狀上皮內(nèi)細(xì)胞病變（high grade squamous cell intra-epithelial lesions，HSILs）高度相關(guān)。
　　 HPVDNA在良性

6、腫瘤和低度癌前病變中多以游離形式存在，而在惡性病變及高度癌前病變中常以單拷貝或多拷貝整合于宿主細(xì)胞基因組中。病毒基因整合入宿主細(xì)胞的部位通常發(fā)生在E1或E2區(qū)。病毒整合時(shí)，E2的斷裂或缺失導(dǎo)致其開放閱讀架失活，對病毒癌基因表達(dá)負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用缺失，使E6、E7基因過度表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞生長失控。因此可以通過E2/E6比來了解HPV與宿主細(xì)胞的整合狀態(tài)，評價(jià)宮頸病變的惡性程度。目前，有關(guān)HPV整合的研究大多數(shù)針對HPV16和18型，研究顯示HP

7、V在不同宮頸病變中的整合率隨HPV感染型別的不同而變化。
　　 由于HPV58在中國乃至亞洲婦女中有著相當(dāng)高的流行率及致癌性，本課題分析了HPV58型的E6、E7、L1基因及LCR的的基因變異情況與宮頸病變的相關(guān)性。通過對感染的HPV58型病毒載量的測定及其與宿主細(xì)胞的整合狀態(tài)的分析，分析其與宮頸病變的相關(guān)性，探討HPV58型在宮頸病變發(fā)生中的致病機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、采用HybriMax法對2938

8、例宮頸拭子標(biāo)本進(jìn)行HPV基因分型檢測，篩選出235例標(biāo)本為單一HPV58型感染，按其對應(yīng)的病理組織學(xué)診斷分組:正常細(xì)胞47例，慢性或急性宮頸炎癥127例，ASCUS19例，CIN-1為15例人，CIN-2和CIN-3為23例，宮頸癌4例。采用半巢式聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分別擴(kuò)增E6、E7、L1基因及LCR調(diào)控區(qū)，然后對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化測序，并與HPV58型標(biāo)準(zhǔn)株比較，分析不同宮頸病變

9、患者的HPV58型各基因變異情況。
　　 2、于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行宮頸癌機(jī)會(huì)篩查的女性中選出102例單一HPV58型感染的陽性標(biāo)本，同時(shí)按其宮頸脫落細(xì)胞或?qū)m頸組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)評價(jià)，分為正常及宮頸炎組34例、LSILs組31例，及HSILs組28例，CC組9例。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定，以E6的含量作為HPV58型的病毒載量，以E2與E6基因的含量計(jì)算E2/E6比值，并根據(jù)cut-off值判斷HPV58的整

10、合狀態(tài)。
　　 結(jié)果
　　 1、單一HPV58型陽性的235個(gè)樣本的基因變異存在多態(tài)性。HPV58型的E6(83.8％)，E7(76.7％)，L1(90.8％)基因及LCR(91.4％)都有很高的基因變異率。其中最常見的變異分別為E6基因的C307T(52.4％)，E7基因的T744G(74.9％)，L1基因的A6014C(56.9％)和LCR的C7266T(53.4％)變異。共有9個(gè)核苷酸變異發(fā)生于E6基因，其中A14

11、0G(T11A)，A184C(E25D)，G266C(V53L)和A313G都是新發(fā)現(xiàn)的變異。E7基因序列呈現(xiàn)4種典型的核苷酸改變，分別為G761A(G63D)，G694A(G41R)， T803C(V77A)和T744G。在L1基因中，共發(fā)現(xiàn)39個(gè)變異發(fā)生在34處核苷酸位點(diǎn)，有13個(gè)氨基酸發(fā)生了替換，大部分變異(21/39)以前都未曾報(bào)道。LCR中，共發(fā)現(xiàn)了29處變異，包括28處堿基替換和一處插入TGTCAGTTTCCT共12bp的變

12、異，其中有8處為新發(fā)現(xiàn)的變異。最常見的發(fā)生在A7714C位的變異位于轉(zhuǎn)錄因子C/EBP結(jié)合位點(diǎn)上，且A7714C的變異顯示其更易出現(xiàn)在宮頸上皮內(nèi)瘤變的病例中(P=0.037)。我國東北地區(qū)婦女感染HPV58型的主要流行株屬于A系，本研究中共有142株HPV58型病毒屬于此系(142/174，81.6％)。
　　 2、本研究中共收集102例HPV基因分型檢測HPV58型感染樣本。所有樣本的HPV58病毒載量經(jīng)過內(nèi)參β-actin標(biāo)

13、準(zhǔn)化后的數(shù)值（copies/基因組當(dāng)量）進(jìn)行比較，各組中位數(shù)分別為:正常及宮頸炎組412.99，LSILs組821.04，HSILs組1039.55及CC組657.04，除CC組外，其余各組病毒載量隨宮頸病變的嚴(yán)重程度而增加，但各組間的病毒載量并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)E2/E6的比值判斷，本研究檢測到的102株HPV58型病毒在體內(nèi)感染狀態(tài)以部分整合型為主，80株(78.4％)為部分整合型，20株(19.6％)為游離型，2株(2.0％)完全

14、整合型。其中CC組與其它三組比較，E2/E6比值顯著降低，P=0.001。
　　 結(jié)論：
　　 1、HPV58型A系是中國東北婦女中最主要的HPV58型流行株。研究中發(fā)現(xiàn)HPV58型基因具有很高的變異率，特別是位于E6，L1基因及LCR調(diào)控區(qū)的新核苷酸變異。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在LCR調(diào)控區(qū)的A7714C變異與HPV58型感染婦女的宮頸病變程度相關(guān)，對于認(rèn)識HPV58型的致病機(jī)制及本地區(qū)的預(yù)防和治療具有重要意義。