急性百草枯中毒大鼠腎組織中PPAR-γ與TGF-β1的表達及5-氨基水楊酸的治療干預研究.pdf

1、目的：百草枯(Paraquat，PQ)，商品名有克無蹤、對草快等，自20世紀50年代末發(fā)現(xiàn)其良好的除草作用后，一直被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。隨著PQ在我國的大量使用，PQ中毒的發(fā)生率也逐年增高。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PQ毒性作用極強，且尚未發(fā)現(xiàn)特效解毒藥，使得PQ成為我國繼有機磷類及擬除蟲菊酯類之后導致農(nóng)藥中毒的第三大種類。目前PQ染毒導致腎臟損傷的機制尚未完全明確。本實驗研究通過測定PQ染毒大鼠的血清超氧化物歧化酶(Superoxide Dis

2、mutase，SOD)活力以及丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(L-Glutathione，GSH)含量，并應用免疫組織化學染色方法觀察過氧化物酶增殖體激活受體-γ(PeroxisomeProliferator Activated Receptor-gamma，PPAR-γ)與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)在PQ染毒大鼠腎組織中的表達以及5-氨基

3、水楊酸(5-Aminosalicy acid，5-ASA)對上述指標的干預影響，進一步探討PQ中毒對腎臟損傷的機制以及5-ASA對百草枯染毒大鼠腎損傷的保護機制，初步探索較大劑量5-ASA對于正常腎組織有無影響。
　　方法：由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供的健康成年雄性Wistar大鼠80只，體重在200-230g之間。動物室溫度控制在20-26℃之間，濕度控制在40-70％之間，動物飼料由實驗動物中心提供，飲用水為純凈水與鹽酸配制

4、的放置24小時后的酸化水(pH2.5-3.0)。正式實驗前適應性飼養(yǎng)3天，根據(jù)體重將大鼠隨機分為4組：①空白對照組(A組)20只；②單純?nèi)径窘M(B組)20只；⑨染毒+治療組(C組)20只；④單純5-ASA對照組(D組)20只。實驗當天早晨8點，B、C兩組分別給予80mg/kg的PQ灌胃染毒，A、D兩組分別給予相同體積的雙蒸水胃內(nèi)灌注。上午10點，C、D兩組分別給予75mg/kg的5-ASA胃內(nèi)灌注，A、B兩組分別給予相同體積的雙蒸水胃內(nèi)

5、灌注。實驗后第1天上午10點，C、D兩組分別給予75mg/kg的5-ASA胃內(nèi)灌注，A、B兩組分別給予相同體積的雙蒸水胃內(nèi)灌注，每日1次，最長用藥時間為7天。A、B、C、D各組于實驗后1d、3d、7d、14d分別取5只大鼠，10％水合氯醛0.35mg/kg腹腔注射全身麻醉，開腹后髂總靜脈取血3-4ml，4000r/h高速離心10min，取上層血清測定SOD活力以及MDA、GSH含量，應用統(tǒng)計學方法進行組間比較；迅速留取右側(cè)腎臟，取腎組織

6、進行HE染色，鏡下觀察超微組織結(jié)構(gòu)，并進行免疫組織化學染色，觀察PPAR-γ和TGF-β1在大鼠腎組織中的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.實驗大鼠臨床表現(xiàn)：A組(空白對照組)及D組(單純5-ASA對照組)大鼠未出現(xiàn)任何中毒表現(xiàn)。B組(單純?nèi)径窘M)大鼠在灌胃染毒后2小時之內(nèi)即出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，染毒后3日內(nèi)癥狀最為明顯。較短時間內(nèi)即可觀察到豎毛，易激惹，厭食水癥狀；之后可出現(xiàn)呼吸困難，尿量減少，體重減輕，部分大鼠有血尿、稀便，口鼻及

7、眼周血性分泌物。C組(染毒+治療組)大鼠經(jīng)5-ASA治療后，中毒表現(xiàn)較B組為減輕，呼吸困難明顯改善，體重下降不明顯，血尿、稀便及口鼻、眼周血性分泌物少見。
　　2.實驗大鼠血清學指標檢測：
　　①B組大鼠血清SOD活力在染毒后的1d為最低，至7d時間點仍明顯低于A組(P<0.01)，后逐漸升高，至14d后與A組相比不再具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C組5-ASA明顯增加了大鼠血清SOD活力，在染毒后的1d、3d、7d時間點

8、均較B組明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；僅1d、3d時間點較A組具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。D組與A組比較，SOD活力在染毒后的所有時間點均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　?、贐組大鼠血清MDA含量在染毒后的1d為最高，至7d時間點仍明顯高于A組(P<0.01)，后逐漸下降，至14d后與A組相比不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C組5-ASA明顯降低了中毒大鼠血清MDA含量，在染毒后的1d、3d、7d時間點均較

9、B組明顯降低(P<0.01)，僅1d、3d時間點較A組具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。D組與A組比較，MDA含量在染毒后的所有時間點均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　?、跙組大鼠血清GSH含量在染毒后的1d為最低，至3d時間點仍明顯低于A組(P<0.01)，后逐漸升高，至7d后與A組相比不再具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C組5-ASA明顯增加了大鼠血清GSH含量，在染毒后的1d、3d、7d時間點均較B組明顯升高，具有統(tǒng)計學

10、意義(P<0.01)；所有時間點較A組均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。D組與A組比較，GSH含量在染毒后的所有時間點均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.實驗大鼠腎組織形態(tài)學變化：
　?、俅篌w形態(tài)：A組大鼠腎臟色澤紅潤正常，被膜無腫脹；B組大鼠腎臟顏色晦暗，被膜腫脹；C組大鼠腎臟與B組相比顏色較紅，被膜腫脹較輕；D組大鼠腎臟色澤紅潤正常，被膜無腫脹。
　　②HE染色：A組大鼠腎組織中腎小球、腎小管、腎間質(zhì)等

11、各部分均未見異常；B組大鼠腎組織改變以腎小管為主，隨著時間的推移，逐漸可見上皮細胞水腫、空泡變性、滲出壞死、管腔內(nèi)可見紅色壞死顆粒；C組大鼠腎組織改變與B組相類似，但程度有所減輕，發(fā)生時間有所延后；D組大鼠腎組織中腎小球、腎小管及腎間質(zhì)均未見異常。
　　4.實驗大鼠腎組織PPAR-γ與TGF-β1免疫組織化學檢測結(jié)果：
　　4.1 PPAR-γ在大鼠腎組織中的分布與表達：
　　①A組大鼠腎組織中，偶見PPAR-γ表達于

12、髓質(zhì)腎小管、集合管上皮細胞核中。②B組大鼠腎組織中，可見PPAR-γ少量表達于腎小管上皮細胞核中，偶見表達于腎血管內(nèi)皮細胞核中。與A組相比，自染毒后1d時間點，PPAR-γ的表達有所增高，1d、3d時間點即具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，7d及14d具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。③C組大鼠腎組織中，PPAR-γ主要表達在腎小管、集合管上皮細胞核中，其次表達在腎小球系膜細胞、腎血管內(nèi)皮細胞等細胞核中，還可觀察到上述細胞的胞漿內(nèi)有少量

13、表達。應用5-ASA治療后，自染毒后1d開始該組大鼠腎組織中PPAR-γ的表達就顯著增高，至14d仍有明顯表達，與A組及B組相比均具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)。④D組大鼠腎組織中，偶見PPAR-γ表達于腎小管上皮細胞核中。與A組相比不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.2 TGF-β1在大鼠腎組織中的分布與表達：
　　①A組大鼠腎組織中，僅在腎小管上皮細胞的胞漿內(nèi)偶可見TGF-β1表達，而在腎小球及腎小管周圍毛細

14、血管等腎間質(zhì)區(qū)未見明顯TGF-β1表達。②B組大鼠腎組織中，TGF-β1主要表達在腎小管上皮細胞的胞漿內(nèi)，自1d時間點開始就顯著增高，至7d到達高峰，且至14d仍有明顯表達，與A組比較具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)。③C組大鼠腎組織中，TGF-β1亦主要表達在腎小管上皮細胞的胞漿內(nèi)。應用5-ASA后自1d至14d其表達較B組減弱，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與A組相比，自1d至14dTGF-β1的表達明顯增高，具有顯著統(tǒng)計學意義

15、(P<0.01)。④D組大鼠腎組織中，TGF-β1在腎小管上皮細胞的胞漿內(nèi)偶見表達，未在腎小球及腎小管周圍毛細血管區(qū)等腎間質(zhì)部位見其表達。
　　結(jié)論：
　　1.PQ灌胃染毒可造成腎臟損傷，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞損傷，表明PQ灌胃染毒是建立急性腎損傷動物模型的可靠方法。以80mg/kg灌胃染毒，劑量合適。
　　2.PQ中毒大鼠血漿中SOD活力降低，MDA含量增加，GSH含量減少，提示中毒大鼠體內(nèi)存在過氧化損傷以及氧化-

16、抗氧化失衡，可能是PQ導致腎臟損傷的機制之一。
　　3.PQ中毒大鼠腎組織中的TGF-β1主要在腎小管上皮細胞的胞漿中表達，可能是造成腎小管損傷的原因之一。而PPAR-γ主要表達于腎小管、集合管上皮細胞的胞核中，說明其可能具有抗衡并修復前者對腎小管損害的作用。
　　4.通過5-ASA治療之后，可明顯增加PQ中毒大鼠血清的SOD活力，降低MDA含量，升高GSH含量，從而減低氧化應激對于腎組織的損傷程度。
　　5.5-AS