從水代謝調(diào)節(jié)途徑探討甘遂和甘草的配伍關(guān)系.pdf

1、目的：
　　本研究從妨害治療角度切入，采用均勻設(shè)計(jì)法明確甘遂-甘草配伍對(duì)甘遂瀉水作用的影響，同時(shí)整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從水代謝調(diào)節(jié)途徑探索相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　　2.1 均勻設(shè)計(jì)法研究反藥組合甘遂-甘草的配伍關(guān)系
　?、偻ㄟ^(guò)H22肝癌腹水模型小鼠確定甘遂抗肝癌腹水作用的有效劑量范圍;
　　②根據(jù)均勻設(shè)計(jì)2因素7水平的原則，觀察7個(gè)不同劑量配比的甘遂-甘草對(duì)肝癌腹水模型小鼠的藥效學(xué)影響;

2、>　?、弁ㄟ^(guò)MATLAB7.8軟件對(duì)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行多元逐步回歸分析，篩選反藥組合甘遂-甘草產(chǎn)生拮抗或協(xié)同的劑量配比范圍。
　　2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略預(yù)測(cè)反藥組合甘遂-甘草配伍機(jī)制
　?、倩谒幬锼衔锝Y(jié)構(gòu)相似性原理，利用Therapeutic Targets Database中的Drugsimilarity search工具，獲得與甘遂、甘草所含化學(xué)成分具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物分子，分別預(yù)測(cè)甘遂、甘草的候選作用靶標(biāo);

3、
　?、诨诘鞍踪|(zhì)相互作用(Protein-protein interaction, PPI)信息構(gòu)建甘遂-甘草抗腹水作用的“藥物-疾病-靶標(biāo)”相互作用分子網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞣治龊头肿訉?duì)接技術(shù)、及候選靶標(biāo)的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息生物學(xué)功能挖掘，篩選并獲得與甘遂-甘草抗腹水作用密切相關(guān)的靶標(biāo)。
　　2.3 反藥組合甘遂-甘草配伍機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　①I(mǎi)CR雄性小鼠按2.1制備H22肝癌腹水模型小鼠，將小鼠按體重隨機(jī)分為正常組

4、、模型組、甘遂-甘草協(xié)同組、甘遂-甘草拮抗組、單獨(dú)甘遂大劑量組、單獨(dú)甘遂小劑量組、速尿組，造模24h后開(kāi)始灌胃給藥，每天1次，共7天;
　　②實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫頸椎處死小鼠，檢測(cè)體重、腹圍、腹水量等藥效學(xué)指標(biāo);酶法檢測(cè)血清肝功能、腎功能;取肝臟、腎臟組織進(jìn)行常規(guī)HE病理切片觀察;
　?、跡LISA法檢測(cè)血清、腹水中β-1腎上腺素能受體(Beta-1 adrenergic receptor，ADRB1)、磷脂酰肌醇(-3)激酶γ亞基

5、(Phosphatidylinositol4，5-bisphosphate3-kinasecatalytic subunit gamma isoform，PIK3CG)、血管加壓素V2受體(Arginine Vasopressinreceptor2，AVPR2)、水通道蛋白-2(Aquaporin2，AQP2)水平;免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)小鼠腎臟的ADRB1、PIK3CG、AVPR2、AQP2的蛋白

6、和mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　3.1 均勻設(shè)計(jì)法研究反藥組合甘遂-甘草的配伍關(guān)系:甘草劑量≥1.03 g/kg且甘草∶甘遂的劑量比≥1.11∶1時(shí)，甘草可顯著拮抗甘遂的抗腹水作用;甘遂劑量＜0.70 g/kg且甘草∶甘遂的劑量比≤0.39∶1時(shí)，甘草對(duì)甘遂的抗腹水產(chǎn)生協(xié)同作用;
　　3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略預(yù)測(cè)反藥組合甘遂-甘草配伍機(jī)制:ADRB1和PIK3CG分別為甘遂和甘草的候選靶標(biāo)，且均與已知抗腹水靶標(biāo)A

7、VPR2具直接相互作用關(guān)系，反藥組合甘草-甘遂在抗肝癌腹水中的配伍機(jī)制，可能與調(diào)節(jié)抗利尿激素分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失衡相關(guān);
　　3.3 反藥組合甘遂-甘草配伍機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究:當(dāng)甘草拮抗甘遂的抗腹水作用時(shí)，甘草抑制甘遂對(duì)其候選靶標(biāo)ADRB1表達(dá)的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)腎臟AVPR2-AQP2的表達(dá)，導(dǎo)致水在腎臟的重吸收增加，加重肝癌腹水;當(dāng)甘草增強(qiáng)甘遂的抗腹水作用時(shí)，二藥分別下調(diào)各自的候選靶標(biāo)PIK3CG和ADRB1，共同降低腎臟AVPR2-AQP2

8、的表達(dá)，抑制抗利尿激素的分泌，促進(jìn)腹水的排泄;
　　3.4 反藥組合甘遂-甘草配伍后不管產(chǎn)生拮抗還是協(xié)同作用，均未對(duì)H22肝癌腹水小鼠的肝、腎功能產(chǎn)生明顯的增毒作用。
　　結(jié)論：
　　本研究明確在一定量比條件下，甘草對(duì)甘遂的瀉水作用產(chǎn)生拮抗或協(xié)同作用，說(shuō)明反藥組合甘遂-甘草是有條件的配伍禁忌;未觀察到該組合產(chǎn)生明顯的肝腎增毒作用;闡明該組合配伍后產(chǎn)生不同藥效結(jié)果的機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗利尿激素分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(ADRB1-PI