甘草與反藥配伍對(duì)P-糖蛋白影響的相關(guān)研究及配伍禁忌對(duì)口服藥物腸道吸收機(jī)制的探討.pdf

1、背景和目的:
　　 P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是屬于ABC(ATP—bindingcassette)轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的能量依賴性膜蛋白，分子量為170kDa，可發(fā)揮外排泵作用，將細(xì)胞內(nèi)的化合物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。P-gp除在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)外，在正常機(jī)體組織和器官如肝臟、腎臟、胎盤、大腦、睪丸及腸刷狀緣膜等部位均有高水平的表達(dá)。存在于腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜中的P-gp能將藥物從漿膜

2、側(cè)泵回至粘膜側(cè)而進(jìn)入腸腔排出，導(dǎo)致藥物透膜吸收減少，血藥濃度降低。因此，受腸粘膜P-gp調(diào)控的經(jīng)腸道吸收藥物可以通過抑制腸粘膜P-gp的活性而增加吸收，提高生物利用度?，F(xiàn)已證實(shí)，許多藥物均為腸粘膜P-gp的抑制劑，例如維拉帕米、環(huán)胞菌素A、奎尼丁、一些表面活性劑等。
　　 中藥十八反是中醫(yī)界沿襲數(shù)千年的用藥禁忌。有研究表明，甘草與反藥合用前后對(duì)細(xì)胞色素P450具有不同的調(diào)控作用。令人感興趣的是P-gp的底物特異性很大程度上與細(xì)胞

3、色素P450同工酶(CYP3A1-3)相似，二者有很多重疊的底物，如利福平、利多卡因、地高辛以及環(huán)孢菌素等。那么，這些反藥對(duì)合用前后也有可能對(duì)腸粘膜P-gp產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用，這可能是反藥合用引起臨床上產(chǎn)生毒性的原因。文獻(xiàn)檢索表明，目前國(guó)內(nèi)外尚未見由探討腸粘膜P-gp的表達(dá)同中藥配伍合理性之間的研究報(bào)告，因此探討中藥反藥對(duì)合用后毒性增加是否同P-gp表達(dá)的改變等研究具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值。
　　 本課題選擇十八反藥對(duì)中的甘草，甘遂，

4、海藻，京大戟作為模型藥進(jìn)行研究。參考2010年版《中國(guó)藥典》對(duì)所選中藥材進(jìn)行質(zhì)量控制后，中藥材按傳統(tǒng)方法進(jìn)行煎煮，制備甘草水提液，反藥水提液及甘草反藥合煎水提液，甘草反藥合并水提液。選擇典型的P-gp抑制劑維拉帕米為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以生理鹽水為陰性對(duì)照藥物。將中藥水提液，維拉帕米，生理鹽水分別對(duì)Wistar大鼠灌胃造模，利用體外擴(kuò)散池法(Ussingchamber)，Real-timePCR法，在體Insitu實(shí)驗(yàn)法，分析甘草與反藥合用前

5、后對(duì)大鼠腸粘膜P-gp表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)中，將P-gp典型底物藥物羅丹明123(R123)和旁細(xì)胞途徑藥物熒光素鈉(CF)分別作為轉(zhuǎn)運(yùn)方式的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。Ussingchamber體外實(shí)驗(yàn)中，R123和CF都具有可見光范圍的熒光，故應(yīng)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高。實(shí)驗(yàn)成功建立了熒光分光光度計(jì)對(duì)腸粘膜透過液中R123和CF檢測(cè)的方法學(xué)，選取了灌胃的最佳濃度及能夠反應(yīng)腸道吸收機(jī)制的最佳腸段。Insitu體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用LC-MS/

6、MS首次建立了大鼠血漿中檢測(cè)R123的方法學(xué)，期望通過對(duì)R123及CF的檢測(cè)能間接地說明甘草反藥合用前后對(duì)P-gp調(diào)控的規(guī)律性?；蛩綄?shí)驗(yàn)中，選擇mdrla為目的基因，各個(gè)組織中表達(dá)量相對(duì)恒定的β-actin為內(nèi)參基因分析造模大鼠不同區(qū)段腸道的P-gp表達(dá)情況，闡明甘草反藥合用引起毒性增加的可能作用機(jī)制。
　　 內(nèi)容和結(jié)果:
　　 中藥根據(jù)不同產(chǎn)地、不同炮制方法，質(zhì)量存在很大差別，因此要首先對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用的甘草，甘遂，海

7、藻，京大戟進(jìn)行質(zhì)量控制。參考2010年版《中國(guó)藥典》含量測(cè)定的方法，分別選擇甘草酸銨，甘草苷，丹酚酸B（首次從京大戟中分離得到），大戟二烯醇為對(duì)照品。選擇InertsilODS-SPC18柱(4.6×150mm，5μm)為色譜柱;柱溫:40℃;流動(dòng)相:A為乙腈，B為0.05％磷酸水溶液。其中甘草酸銨，甘草苷用于甘草水提液的含量測(cè)定:波長(zhǎng)為237nm;采取梯度洗脫。大戟二烯醇用于甘遂的含量測(cè)定:流動(dòng)相:A為乙腈，B為0.05％磷酸水溶液;

8、A∶B=95∶5;波長(zhǎng)為237nm，流速:1ml/min。大戟二烯醇，丹酚酸B用于京大戟含量測(cè)定:波長(zhǎng)為210nm;采用梯度系統(tǒng)。甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品，甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品，丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品，大戟二烯醇標(biāo)準(zhǔn)品（A用于甘遂水提液檢測(cè)，B用于京大戟水提液檢測(cè)）在各自的色譜條件下，重現(xiàn)性良好，各自保留時(shí)間分別約為:43.09±0.17min,25.02±0.10min,40.09±0.07min,13.46±0.18min(A),74.09±0.14min(

9、B)。含量測(cè)定中，甘草水提液中所含甘草苷的量為0.6％，甘草酸的量為2.2％，甘遂水提液中所含大戟二烯醇的量為0.2％，均大于藥典規(guī)定的含量。實(shí)驗(yàn)首次對(duì)京大戟進(jìn)行含量測(cè)定，京大戟水提液中含大戟二烯醇的量為0.1％，丹酚酸B的量為2.0％。
　　 應(yīng)用熒光分光光度計(jì)，建立R123及CF檢測(cè)方法學(xué)。R123的激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm，CF的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm。R123在(10～200)μg·

10、l-1，熒光強(qiáng)度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=0.2237X+2.5658(r2=0.9993)，回收率和日內(nèi)精密度分別為:99.9％和0.9％。CF在(200～2000)μg·l-1，熒光強(qiáng)度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=0.6386X+0.0679（r2=1），回收率和日內(nèi)精密度分別為:99.8％和2.3％。
　　 應(yīng)用LC-MS/MS，建立大鼠血漿中R123的檢測(cè)方法學(xué)。0.1ml血漿樣品用乙酸乙酯-二氯甲烷提取。用羅丹明

11、6G作為內(nèi)標(biāo)。利用C18柱分離R123及R6G。檢測(cè)方式為正離子電離，多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，用于定量分析的離子為R123m/z:345-285，R6Gm/z:443-415。樣品運(yùn)行時(shí)間為4min，標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為:1-200ng/ml，最低檢測(cè)限為1ng/ml。低濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度及日間精密度分別為6.96％和9.2％，中間濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度及日間精密度分別為3.33％和3.02％，高濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度及日間

12、精密度分別為1.41％和2.09％，三種濃度的質(zhì)控樣品在日間精密度及日內(nèi)精密度中的誤差均在0.12％-3.24％之間。
　　 使用體外Ussingchamber實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)R123、CF經(jīng)不同區(qū)段腸粘膜的經(jīng)時(shí)吸收方向和分泌方向的累計(jì)透過率和表觀滲透系數(shù)(Papp)及泵出比ER。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。藥物不同濃度不同區(qū)段的Papp比較用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，不同組間多重比較采用SNK法檢驗(yàn);各組累計(jì)透過率的比

13、較用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，不同組間多重比較采用LSD法檢驗(yàn);各組間不同方向，不同區(qū)段的Papp及ER的均數(shù)比較用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，不同組間多重比較采用SNK法檢驗(yàn)。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。
　　 生理鹽水組，R123在空腸回腸結(jié)腸中的分泌方向轉(zhuǎn)運(yùn)大于吸收方向轉(zhuǎn)運(yùn)，泵出比ER分別為空腸ER=5.69±4.13;回腸ER=3.51±2.20;結(jié)腸ER=2.02±0.84。表明其在小腸中的轉(zhuǎn)運(yùn)是以分泌為主，說明泵出系統(tǒng)的存在

14、。維拉帕米組，R123在空腸回腸結(jié)腸中的吸收方向轉(zhuǎn)運(yùn)大于分泌方向，泵出比分別為空腸:ER=0.42±0.33，回腸ER=0.41±0.25，結(jié)腸ER=1.23±1.16。維拉帕米作為P-gp的典型抑制劑，表明其口服后，可顯著抑制P-gp的表達(dá)，使R123在小腸中的轉(zhuǎn)運(yùn)是以吸收為主。
　　 使用體外Ussingchamber實(shí)驗(yàn)考察不同濃度（0.25g/ml，0.5g/ml，1g/ml）中藥水提液灌胃大鼠1周后，R123經(jīng)空腸粘膜

15、M-S方向和S-M方向的影響。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度與吸光度的效應(yīng)關(guān)系用線性回歸分析（LinearRegression）。各組中分泌方向累計(jì)透過率與吸收方向累計(jì)透過率的比較用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析;各組間不同方向，不同區(qū)段的Papp及ER的均數(shù)比較用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，不同組間多重比較采用SNK法檢測(cè)。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3種濃度的甘草水提液灌胃后，R123在吸

16、收方向與分泌方向中的透過與生理鹽水組（0.28±0.15和1.16±0.46）比較，沒有顯著性差異。3種濃度的甘遂水提液，海藻水提液，京大戟水提液灌胃后，R123經(jīng)空腸粘膜M-S方向的透過按濃度增高而增加。但是1g/ml灌胃時(shí)，R123分泌方向的透過均高于0.25g/ml，0.5g/ml的透過。提示濃度過高可能影響了P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)的飽和性。故選擇0.5g/ml作為中藥灌胃濃度。
　　 將大鼠灌胃各種中藥液，1周后用體外Ussing

17、chamber法評(píng)價(jià)各種藥液對(duì)R123經(jīng)各區(qū)段腸粘膜透過性的影響。研究空腸吸收時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草液可以降低R123經(jīng)空腸粘膜吸收分泌雙方向的轉(zhuǎn)運(yùn)，甘遂使R123吸收增加，分泌減小，ER顯著降低，甘遂合煎與合并液吸收分泌之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均可以使R123分泌顯著降低，吸收顯著增加，ER顯著降低;海藻使分泌吸收雙方向透過增加，但ER有降低趨勢(shì)，海藻合煎與合并液吸收分泌之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均可以使雙方向透過增加，但是ER顯著降低京大戟可以使分泌降

18、低，吸收增加，ER顯著降低，其合煎液與合并液之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是與京大戟相比，分泌顯著降低，吸收增加。研究回腸方向時(shí)，甘草降低R123吸收分泌雙方向的透過。除海藻外，甘遂與京大戟均時(shí)R123吸收方向透過增加，分泌方向減小，ER顯著降低。甘草與甘遂，海藻，京大戟合用時(shí)，合煎與合并組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除海藻與甘草合用時(shí)使雙方向透過顯著增加，且ER與空白組無顯著性差異外，甘草與甘遂合并及甘草與京大戟合并均可使分泌方向降低，吸收方向R123

19、增加，ER與空白組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)腸時(shí)，藥物合用后各自之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除京大戟可使R123分泌方向轉(zhuǎn)運(yùn)降低外，其余藥物組的吸收及分泌方向均為升高趨勢(shì)。
　　 將大鼠灌胃各種中藥液，1周后用體外Ussingchamber法評(píng)價(jià)各種藥液對(duì)CF經(jīng)各區(qū)段腸粘膜透過性的影響。除了回腸中，京大戟使CF在吸收分泌方向透過均增加外，其余藥物組在空腸及回腸中均使CF的透過顯著降低?？漳c與回腸各組相比趨勢(shì)相同，提示藥物對(duì)空腸與回

20、腸的影響相似。各自藥物在結(jié)腸實(shí)驗(yàn)時(shí)，均使CF的透過顯著降低。
　　 基因水平實(shí)驗(yàn)中，選擇mdrla為目的基因，各個(gè)組織中表達(dá)量相對(duì)恒定的β-actin為內(nèi)參基因分析造模大鼠不同區(qū)段腸道的P-gp表達(dá)情況，闡明甘草反藥合用引起毒性增加的可能作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，不同組間多重比較采用LSD法檢測(cè);以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？疾彀l(fā)現(xiàn)，空白組空腸，

21、回腸，結(jié)腸mdrla表達(dá)依次升高，而維拉帕米組空腸，回腸，結(jié)腸mdrla表達(dá)，依次降低?？漳c，回腸組海藻及其與甘草合并組對(duì)mdrla表達(dá)與空白組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。甘遂具有降低mdrla表達(dá)的趨勢(shì)，但是與空白組相比，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。京大戟可以顯著降低mdrla的表達(dá)，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。甘遂與甘草合并，京大戟與甘草合并，均可以降低mdrla的表達(dá)。各自藥物對(duì)結(jié)腸mdrla的影響均無顯著性差異。
　　 根據(jù)體外結(jié)果，

22、應(yīng)用小腸作為主要部位，在體Insitu實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠灌胃甘草水提液，京大戟水提液，甘草京大戟合并藥液后，R123和CF在血漿中藥物濃度的變化，計(jì)算各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CF各組濃度與峰面積的效應(yīng)關(guān)系用線性回歸分析(LinearRegression)。R123及CF藥物在腸道內(nèi)吸收后Cmax、Tmax、AUC0-240min、F的均數(shù)比較各自均采用單向方差分

23、析（One-WayANOVA），如果有顯著性差異，則組間兩兩比較采用LSD法（方差齊性時(shí)）或DunnettT3法（方差不齊時(shí)）;LDH及總蛋白含量測(cè)定的均數(shù)比較采用采用單向方差分析（One-WayANOVA），如果有顯著性差異，則組間兩兩比較采用LSD法（方差齊性時(shí)）或DunnettT3法（方差不齊時(shí)）。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草組R123最高血漿濃度Cmax、曲線下面積AUC0-240mim和生物

24、利用度F與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而京大戟、合并組Cmax、AUC0-240min和F均大于對(duì)照組(P＜0.01)，并且合合并組AUC0-240和F與京大戟組相比，增加了將近一倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，;大鼠灌胃京大戟后，CF的各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論和討論
　　 結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推斷甘遂和京大戟可以抑制P-gp的表達(dá)，且京大戟的抑制作用更加明顯，甘遂與京大戟在與甘草分別合并

25、使用后對(duì)P-gp表達(dá)的抑制加強(qiáng)，這可能是其產(chǎn)生配伍禁忌的原因之一。海藻和甘草單用及合用對(duì)P-gp的表達(dá)的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二者配伍禁忌可能不是由P-gp影響造成的。那么在臨床上，甘遂與京大戟有可能配伍一些易產(chǎn)生耐藥性的抗腫瘤藥物，或者制成腫瘤藥物耐藥性逆轉(zhuǎn)劑，以增加抗癌療效;也可以嘗試在藥物的制備中，適當(dāng)加入甘遂或京大戟，改善一些P-gp底物藥物的吸收。而甘遂對(duì)CF的作用可能是甘遂一方面抑制其吸收，另一方面抑制分泌，吸收和分泌量都

26、減少，從而導(dǎo)致其最終生物利用度與對(duì)照組無差異，這結(jié)果與甘遂是P-gp的抑制劑并不矛盾，京大戟使CF吸收分泌雙方向均增加，且ER與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示可能是由于打開了腸黏膜緊密連接的原因。
　　 中醫(yī)素有“十方九草，無草不成方”之說，甘草配伍其他藥物可以起到增強(qiáng)藥物療效的作用。實(shí)驗(yàn)表明甘草對(duì)P-gp沒有影響，甘草與反藥合用后可能直接或間接對(duì)P-gp產(chǎn)生調(diào)控作用，改變了胃腸粘膜通透性，從而引起不同藥物吸收的增加。這為將來對(duì)甘草“

27、調(diào)和諸藥、增強(qiáng)療效”的作用機(jī)制研究，提供了一個(gè)很好的方向，可以試圖從甘草對(duì)腸粘膜中各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響方面進(jìn)行研究，科學(xué)地認(rèn)識(shí)甘草對(duì)不同轉(zhuǎn)運(yùn)方式的藥物經(jīng)胃腸道粘膜滲透和吸收影響的可能機(jī)制，從而為臨床廣泛應(yīng)用甘草配伍其他藥物提高療效提供更多的依據(jù)。
　　 甘草反藥合用后與單用反藥相比，對(duì)P-gp抑制作用增強(qiáng)，但是合煎與合并兩種炮制方法對(duì)P-gp的影響無差異。我們可以推斷甘草與反藥配伍有毒，可能是甘草對(duì)反藥有協(xié)同作用，使反藥中某些抑制