他克林所致HepG2細(xì)胞的遺傳毒性及桑黃多糖保護(hù)作用的研究.pdf

1、他克林是第一個(gè)美國(guó)食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)上市的治療阿爾茨海默?。ɡ夏臧V呆癥）的藥物，作用機(jī)制為抑制膽堿酯酶活性，用于輕中度老年癡呆癥治療。但在臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，他克林有明顯的肝毒性，表現(xiàn)為患者服藥數(shù)周后30-50％的病例會(huì)出現(xiàn)肝損傷相關(guān)指標(biāo)，即血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高，反應(yīng)嚴(yán)重的患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值升高至正常值的3倍，還有極少數(shù)患者血清ALT水平可升高到正常值的20倍，甚至有引起病理性黃疸的個(gè)案報(bào)道。
　　他克林肝毒性的機(jī)制尚未

2、完全闡明，目前研究?jī)A向于他克林導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死的主要機(jī)制是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，他克林能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，主要機(jī)制在于引起細(xì)胞ROS過(guò)量生成和線(xiàn)粒體DNA的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)形成，進(jìn)一步引起線(xiàn)粒體功能障礙、細(xì)胞色素C釋放、激活caspase-3而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。
　　有研究認(rèn)為，許多藥物的藥效和損傷機(jī)制均來(lái)源于基因毒性及遺傳毒性機(jī)制，例如順鉑、阿霉素和卡鉑等許多化學(xué)治

3、療藥物都具有基因毒性，這些藥物可以通過(guò)產(chǎn)生ROS途徑介導(dǎo)DNA損傷誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡以及阻止細(xì)胞分裂而將腫瘤細(xì)胞殺死，但同時(shí)這些藥物抗腫瘤治療的不良反應(yīng)即基因毒性對(duì)正常增殖活躍細(xì)胞的毒性影響所致，可以造成正常細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變，例如，染色體遺傳信息的異?？刹煌潭鹊赜绊懮餀C(jī)體的生存，輕者突變，重者細(xì)胞死亡。
　　有關(guān)他克林遺傳毒性曾有文獻(xiàn)報(bào)道，但是采用不同試驗(yàn)體系得出的結(jié)論也不一致。因此，本研究目的之一擬采用人HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)體

4、系，對(duì)他克林的基因毒性和遺傳毒性進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步明確他克林的遺傳毒性并證實(shí)遺傳毒性是引起肝細(xì)胞毒性的主要機(jī)制。人體肝胚細(xì)胞瘤來(lái)源的HepG2細(xì)胞，保留許多正常肝細(xì)胞的特征，如Ⅰ相代謝酶以及Ⅱ相代謝酶的活性，與其他不具備完整代謝功能的細(xì)胞模型相比，HepG2細(xì)胞更能反映外源性生物活性物質(zhì)在體內(nèi)的代謝過(guò)程。因此，被作為重要體外模型廣泛用于評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性、細(xì)胞保護(hù)作用、抗遺傳毒性。
　　桑黃作為傳統(tǒng)草藥在東亞地區(qū)被廣泛使用于治

5、療消化道疾病以及婦科疾病，在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中治療胃腸道疾病療效確切?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)桑黃的提取物具有很好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗器官纖維化等廣泛的藥理作用，桑黃在肝臟保護(hù)方面的報(bào)道較多。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，桑黃多糖對(duì)他克林誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能障礙及細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。本研究第二個(gè)目的擬探討桑黃多糖對(duì)他克林誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的遺傳毒性的保護(hù)作用。
　　目的:明確他克林對(duì)HepG2細(xì)胞的遺傳毒性并明確其產(chǎn)

6、生機(jī)制，并觀(guān)察桑黃多糖對(duì)他克林誘導(dǎo)的遺傳毒性的保護(hù)作用。
　　方法:選取傳代培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組采用18.8和37.5μM他克林進(jìn)行細(xì)胞處理，保護(hù)組采用0.0625 mg/ml桑黃多糖預(yù)處理，微核實(shí)驗(yàn)觀(guān)察桑黃多糖對(duì)他克林所致細(xì)胞遺傳毒性的保護(hù)作用，彗星試驗(yàn)檢測(cè)DNA斷裂，2'，7'-二氫二氯熒光素法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，細(xì)胞免疫組織化學(xué)法觀(guān)察8-OHdG水平，熒光比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平，采用黃嘌呤氧化

7、酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用改良比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性，采用二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)直接顯色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性。
　　結(jié)果:隨著他克林濃度的升高，HepG2細(xì)胞的微核形成率、DNA斷裂程度、8-OHdG和ROS水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而GSH水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。桑黃多糖預(yù)處理后，與相同濃度的單獨(dú)他克林處理組比，HepG2細(xì)胞的微核形成率、D

8、NA斷裂程度、8-OHdG和ROS水平均顯著降低(P＜0.05)，GSH水平則顯著升高(P＜0.05)，對(duì)抗氧化酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示，隨著他克林濃度的升高，HepG2細(xì)胞中SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著下降(P＜0.05)，而桑黃多糖預(yù)處理組，與相同濃度的單獨(dú)他克林處理組比，HepG2細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:他克林可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的遺傳毒性;桑黃多糖對(duì)他克林誘導(dǎo)的H