高劑量esiRNA引起adar-1基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的初步研究.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于各種生物中，在進(jìn)化上非常保守的一種轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默的機(jī)制。隨著RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，大量的研究小組將RNA干擾作為高效實(shí)用的工具來(lái)對(duì)基因功能、信號(hào)傳導(dǎo)通路以及疾病的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究。但是對(duì)于RNA干擾的調(diào)節(jié)機(jī)制卻研究的很少，雖然有一些可以調(diào)控RNA干擾信號(hào)的蛋白質(zhì)已經(jīng)被鑒定并進(jìn)行了功能的探討。本實(shí)驗(yàn)室前人的工作已經(jīng)證明：當(dāng)高劑量的esiRNA進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)時(shí)，會(huì)引起RNA特異性的脫氨酶基

2、因adar-1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，導(dǎo)致高劑量esiRNA干擾的效果不佳。而如果同時(shí)引入adar-1和eri-1基因esiRNA，則可以改善沉默靶基因的效果。這些現(xiàn)象引起對(duì)于adar-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的關(guān)注。因此，后續(xù)的研究對(duì)adar-1基因啟動(dòng)子對(duì)于高劑量esiRNA誘導(dǎo)的響應(yīng)進(jìn)行了初步的探索。
　　 在這部分工作中，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和分泌型堿性磷酸酶(SEAP)為報(bào)告基因，構(gòu)建了帶有不同長(zhǎng)度adar-1基因啟動(dòng)子區(qū)

3、域的質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒和非特異性esiRNA共轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞中。通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的強(qiáng)度以確定能夠響應(yīng)高劑量esiRNA誘導(dǎo)的最小區(qū)段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：adar-1基因啟動(dòng)子能夠響應(yīng)高劑量esiRNA誘導(dǎo)的最小區(qū)段位于起始密碼子ATG上游200bp以內(nèi)。為了進(jìn)一步確定響應(yīng)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子元件，對(duì)此200bp的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)的檢索，將得分最高的PU.1啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)確定為響應(yīng)高劑量esiRNA誘導(dǎo)的候選元件。既而，采用缺失突變的

4、方法對(duì)該轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)在esiRNA誘導(dǎo)adar-1基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PU.1啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)缺失后，adax-1基因啟動(dòng)子無(wú)法響應(yīng)esiRNA的劑量誘導(dǎo)，綠色熒光及培養(yǎng)基中分泌型堿性磷酸酶含量較對(duì)照組不再有差別；而當(dāng)把該元件插入adar-1基因起始ATG上游180bp前端后，adaz-1啟動(dòng)子又恢復(fù)其對(duì)于高劑量esiRNA的響應(yīng)。因此說(shuō)明，高劑量esiRNA引起adar-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)主要是通過(guò)其啟動(dòng)子的PU.1元件發(fā)

5、揮作用的。為了證明轉(zhuǎn)錄因子PU.1在高劑量esiRNA引起adar-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)中所其的作用，又將特異性的PU.1 esiRNA轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中以沉默內(nèi)源性PU.1基因，然后觀察esiRNA上調(diào)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)內(nèi)源性PU.1被knock down后，高劑量的esiRNA進(jìn)入細(xì)胞后，不再能誘導(dǎo)adar-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光強(qiáng)度及培養(yǎng)基中分泌型堿性磷酸酶含量無(wú)明顯加強(qiáng)。而當(dāng)使用過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子PU.1蛋白的方法模擬