1型糖尿病對(duì)去勢(shì)大鼠骨改建的影響及機(jī)制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)作為一種系統(tǒng)性骨病一直被眾多科研工作者和臨床醫(yī)務(wù)人員所關(guān)注，其主要表現(xiàn)為骨量減少，骨脆性增加以及骨折。隨著我國乃至世界范圍內(nèi)人口老齡化的到來，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的醫(yī)療問題和社會(huì)問題。另外，一些其他因素如全身性疾病引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥也嚴(yán)重威脅著人類的健康。其中，糖尿病性骨質(zhì)疏松癥因骨質(zhì)破壞嚴(yán)重、骨折并發(fā)率高等特征，受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近年

2、來，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者糖尿病發(fā)病率正在逐年升高，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者并發(fā)糖尿病后的骨質(zhì)改變及其相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步闡明將為如何提高老年婦女的生活質(zhì)量提供有意義的理論依據(jù)。
　　目的:
　　本研究擬通過建立單純絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、單純1型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥及伴發(fā)1型糖尿病的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)1型糖尿病對(duì)去勢(shì)模擬的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨改建的影響并探討相關(guān)機(jī)制，以期為骨質(zhì)疏松癥的臨床干預(yù)和治療提供理論支撐。

3、>　　方法:
　　第一部分:8周齡雌性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組（BC組），去勢(shì)組（ED組），1型糖尿病組（DM組），去勢(shì)合并1型糖尿病組（ED+DM組），每組10只。ED和ED+DM組切除雙側(cè)卵巢，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型。4周后對(duì)DM組和ED+DM組大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(1％ STZ，pH4.5,50mg/kg)，分別建立1型糖尿病骨質(zhì)疏松癥和伴發(fā)1型糖尿病的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型。各組大鼠達(dá)21周齡

4、時(shí)，每組隨機(jī)選擇5只大鼠脫頸處死，分離雙側(cè)脛骨，經(jīng)4％多聚甲醛液外固定、PBS沖洗、組織修剪等一系列步驟后，將脛骨沿其長軸方向排列并固定，置入Micro CT中進(jìn)行掃描。掃描參數(shù):掃描電壓80kVp，電流500μA，分辨率10μm，曝光時(shí)間2500ms。選取距脛骨生長板遠(yuǎn)端1.0mm，厚度1.0mm松質(zhì)骨為感興趣區(qū)域(ROI)，應(yīng)用Micro CT自帶的Inveon Research Workplace2.2軟件進(jìn)行三維重建。應(yīng)用軟件分

5、析ROI區(qū)域的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV，％），骨小梁厚度(Tb.Th，μm)，骨小梁數(shù)量(Tb.N，1/mm)，骨小梁分離度（Tb.Sp，μm），骨小梁模式因子(Tb.Pf,1/mm)及骨密度(BMD，mg/cm3)。
　　第二部分:動(dòng)物模型及分組情況同第一部分，各組大鼠達(dá)21周齡時(shí)，每組選擇5只大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛液進(jìn)行心臟內(nèi)灌注固定，分離大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，經(jīng)過固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列步

6、驟后，制備長骨冠狀向5μm連續(xù)切片。對(duì)切片行HE染色評(píng)價(jià)組織學(xué)形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色和酶化學(xué)染色檢測(cè)成骨相關(guān)因子(ALP)和破骨相關(guān)因子(TRAP、CK)的表達(dá)情況。每個(gè)標(biāo)本選擇10張切片，每個(gè)切片選擇3個(gè)不同的視野應(yīng)用IPP軟件進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)和免疫染色強(qiáng)度分析。
　　第三部分:動(dòng)物模型及分組情況同第一部分，大鼠脫頸處死后，分離股骨，采用Trizol法提取股骨組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。分別檢測(cè)

7、Wnt/β-catenin(LRP5、β-catenin、Runx2)和NF-κB（RANKL、OPG、RANKL/OPG、TRAF6、NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　第一部分:①大鼠空腹血糖變化情況:STZ注射后，DM組、ED+DM組血糖與時(shí)間呈正相關(guān)(P＜0.01)，其中ED+DM組略高于DM組，BC組和ED組未見明顯變化。②大鼠體重變化情況:ED組體重與時(shí)間呈正相關(guān)（P＜0.01），

8、DM組、ED+DM組體重與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），BC組未見明顯變化。③骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù):同BC組相比，ED、DM、ED+DM組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N及BMD均降低（P＜0.05），其中ED+DM組最低;ED組BV/TV、Tb.N低于DM組，Tb.Th、BMD高于DM組（P＜0.05）。與BC組比較，ED、ED+DM組的Tb.Sp均升高（P＜0.05），DM組未見明顯差異;ED、DM、ED+DM組Tb.Pf均升高（P＜0

9、.05），ED+DM組最高，DM組與ED組之間未見明顯差異。
　　第二部分:①ALP免疫組織化學(xué)染色:四組中ED組ALP表達(dá)最強(qiáng)(P＜0.05)，在生長板下方和骨小梁表面可見大量的ALP陽性成骨細(xì)胞;ED+DM組最低（P＜0.05），僅在生長板下方可見極少量的ALP陽性細(xì)胞，骨小梁表面幾乎不可見;DM組ALP表達(dá)強(qiáng)度較ED+DM組略高，仍低于BC組和ED組（P＜0.05），在生長板下方可見散在的ALP陽性細(xì)胞，部分骨小梁表面可見少

10、量ALP陽性成骨細(xì)胞。②TRAP陽性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及CK免疫組織化學(xué)染色:與BC組比較，ED組破骨細(xì)胞數(shù)量最多(P＜0.05)，其破骨細(xì)胞不僅胞核多，體積大，而且CK表達(dá)強(qiáng)度較高(P＜0.05); DM組、ED+DM組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量較少（P＜0.05），破骨細(xì)胞CK表達(dá)強(qiáng)度低（P＜0.05），細(xì)胞體積小，胞核數(shù)量少，DM組與ED+DM組的破骨細(xì)胞數(shù)量及CK表達(dá)強(qiáng)度未見明顯差異。
　　第三部分:①骨組織Wnt/β-caten

11、in信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá):ED組LRP5的表達(dá)最高（P＜0.01），ED+DM組最低(P＜0.01)，BC組和DM組未見明顯差異;ED組β-catenin的表達(dá)最高（P＜0.01），DM組和ED+DM組略低，ED+DM組低于DM組(P＜0.05); ED組Runx2的表達(dá)明顯升高（P＜0.01），DM組和ED+DM組略降低(P＜0.05)，DM組和ED+DM組之間未見差異。②骨組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá):ED組R

12、ANKL的表達(dá)略升高(P＜0.05)，ED+DM組明顯升高(P＜0.01)，DM組未見明顯變化;四組OPG的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RANKL/OPG比值與RANKL的表達(dá)趨勢(shì)相同，ED組略升高(P＜0.05)，ED+DM組最高(P＜0.01)，DM組未見明顯變化;ED組、DM組、ED+DM組TRAF6的表達(dá)均升高（P＜0.05），其中ED組升高較明顯(P＜0.01)，但是ED組、DM組、ED+DM組三組間未見明顯差異;ED組NF-κB的表

13、達(dá)升高(P＜0.01)，DM組、ED+DM組降低(P＜0.01)，DM組和ED+DM組之間未見明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、去勢(shì)與1型糖尿病造成的骨質(zhì)疏松在骨小梁形態(tài)上存在明顯差異，前者主要表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量的減少和缺失;后者則表現(xiàn)為骨小梁厚度明顯變細(xì)，骨小梁斷裂。去勢(shì)合并1型糖尿病時(shí)骨小梁數(shù)量明顯減少，髓腔空隙明顯增加，骨質(zhì)破壞和丟失程度最為嚴(yán)重。
　　2、在去勢(shì)引起的骨質(zhì)疏松模型中，NF-κB和Wnt/β-cate