Fe3O4亞微米粒子固定化NAD激酶生產(chǎn)NADP(H)的研究.pdf

1、超順磁性亞微米粒子在生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力引起了廣泛關(guān)注和研究。本文采用溶劑熱法制備超順磁性Fe3O4亞微米粒子，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷的環(huán)氧修飾活化后，簡(jiǎn)便高效地連接上亞氨基二乙酸(IDA)，并螯合二價(jià)金屬離子(Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+)，得到固定化酶的金屬螯合親和介質(zhì);采用溶劑熱法一步合成MgFe2O4亞微米粒子,作為酶的固定化介質(zhì)。文中對(duì)金屬螯合親和介質(zhì)進(jìn)行一系列的表征，證實(shí)Fe3O4為400nm左右的球狀結(jié)構(gòu)，

2、成功地修飾上IDA，并螯合金屬離子;MgFe2O4是440nm左右的球狀粒子，為反尖晶石結(jié)構(gòu)。
　　NAD(H)及其磷酸化產(chǎn)物NADP(H)是代謝生命活動(dòng)中的重要輔酶，NADPH更是合成代謝反應(yīng)重要的還原力。NADP合成途徑是以NAD激酶(NADK)為唯一酶催化NAD磷酸化生成的。但由于產(chǎn)物NADP對(duì)NADK具有較大抑制作用，在細(xì)胞內(nèi)會(huì)制約其產(chǎn)生。本研究中的NADK來(lái)自E.coli MG1655，經(jīng)基因工程利用質(zhì)粒pET-28a得

3、到產(chǎn)6×His-TaggedNADK的工程菌，過(guò)表達(dá)后固定到金屬螯合Fe3O4亞微米粒子（Fe3O4-IDA-Ni）或MgFe2O4上并用于體外催化NAD生產(chǎn)NADP。
　　本研究驗(yàn)證了Fe3O4-IDA-Ni和MgFe2O4對(duì)His-TaggedNADK固定化的特異性和穩(wěn)定性。經(jīng)測(cè)定，F(xiàn)e3O4-IDA-Ni固定化NADK的量在25℃下固定5min可達(dá)140mg/g介質(zhì)，固定12h可達(dá)到720mg/g介質(zhì);MgFe2O4固定化N

4、ADK在25℃下固定5min可達(dá)100mg/g介質(zhì)，固定12h可達(dá)到670mg/g介質(zhì)。采用高效液相色譜法建立了NAD(H)、NADP(H)的分析方法，在單泵恒流速地簡(jiǎn)便操作條件下，7min內(nèi)得到分離結(jié)果。并測(cè)定了固定化NADK的比活力，F(xiàn)e3O4-IDA-Ni固定化NADK為1.8U·g-1，MgFe2O4固定化NADK為1.4U·g-1。
　　對(duì)固定化NADK的催化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，如固定化NADK的添加量、催化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)

5、溫度和底物NAD濃度對(duì)反應(yīng)物NAD轉(zhuǎn)化率的影響。采用響應(yīng)面法對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)Box-Behnken(BBD)中心組合選取反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物濃度作為考察因素，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行擬合。優(yōu)化結(jié)果為:在50℃下，1mL含0.9mmol/L NAD的PBS緩沖液(0.1mmol/L，pH=7.4)加入0.05g的固定化NADK，反應(yīng)13h，F(xiàn)e3O4-IDA-Ni固定化NADK可使NAD轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.7％，在重復(fù)利用5次后