人cAMP依賴型蛋白激酶抑制劑β與人ERp29的克隆、表達(dá)純化和結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、本論文研究包括二部分：(1)人cAMP依賴型蛋白激酶β抑制劑(PKIβ)的表達(dá)純化和結(jié)構(gòu)功能研究(2)人ERp29的克隆、表達(dá)純化以及結(jié)構(gòu)和功能研究。 人cAMP依賴型蛋白激酶β抑制劑(PKIβ)是一種新的耐熱蛋白，它由78個氨基酸殘基組成，理論分子量為8648．2道爾頓，等電點(diǎn)為4．69．實(shí)驗(yàn)證明，人cAMP依賴型蛋白激酶β抑制劑是對PKA催化亞基(C)具有抑制作用的蛋白之一。人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織間的差異表達(dá)表明人PKIB基

2、因可能與人腦膠質(zhì)瘤的形成與人腦的發(fā)育過程有關(guān)。 為了表征人PKIβ結(jié)構(gòu)特征和更好地了解它的生物學(xué)功能，首先，我們利用2D1HCOSY，TOCSY和NOESY等二維核磁共振技術(shù)，在BrukerDMX500核磁共振儀上，用TPPI方法純吸收模式，測得了人PKIβ的一系列二維核磁共振譜圖，得到了部分結(jié)構(gòu)信息。 在此基礎(chǔ)上，我們以M9培養(yǎng)基為介質(zhì)，用15N標(biāo)記人PKIβ，通過高表達(dá)和純化，得到了15N均勻標(biāo)記的人PKIβ樣品，在

3、500兆核磁共振儀上分別對樣品進(jìn)行了2D15N-1HHSQC，2D15N-1HHSQC-TCOSY，2D15N-1HHSOC—NOESY和3D15N-1HHSQC—NOESY等NMR實(shí)驗(yàn)，我們采用“自旋體系識別”和“序列歸屬”的方法對15N均勻標(biāo)記的人PKIβ的上述NMR譜峰進(jìn)行了歸屬，大約90％的15N和1HN峰已經(jīng)得到歸屬。在上述工作的基礎(chǔ)上，我們用化學(xué)位移標(biāo)志(CSI)方法識別人PKIβ的二級結(jié)構(gòu)單元并確定了它們的序列位置。該結(jié)果

4、與我們之前用CD和FTIR獲得的數(shù)據(jù)基本一致。與野兔PKIQNMR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較顯示，人PKIβ很可能也是由具有抑制功能和出核信號功能的二個結(jié)構(gòu)非常相似的結(jié)構(gòu)域組成。 目前我們正試圖表達(dá)和純化一定量的PKAC樣品，深入研究15N標(biāo)記的人PKIβ與PKAC之問的相互作用關(guān)系和特點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)人PKIβ新的功能。 ERp29是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一種重要蛋白，研究表明它在動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，可能具有幫助分泌蛋白折疊和起著分子伴侶的

5、功能。本論文用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)克隆、表達(dá)和純化出大量的人ERp29蛋白，并用圓二色譜(CD)、傅立葉紅外光譜(FTIR)和拉曼(Raman)光譜對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測量，結(jié)果表明人ERp29主要以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，其二級結(jié)構(gòu)相對含量為：α螺旋大約為45％，β折疊約為22％，β轉(zhuǎn)角約為15％，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)約為18％。此外，我們還采用圓二色譜(CD)和傅立葉紅外光譜對人ERp29的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人ERp29在50℃以下，二級結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，幾