應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)篩選p7TP3剪切體1反式激活基因.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)的p7蛋白是存在于HCV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白之間的63個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)小蛋白，它在脂質(zhì)膜中形成陽(yáng)離子通道。p7蛋白對(duì)病毒顆粒感染性的產(chǎn)生是必需的。利用基因芯片技術(shù)對(duì)p7蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2的基因表達(dá)譜變化進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)p7蛋白可以反式調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，其中包括一個(gè)未知功能基因，命名為p7TP3。在研究p7TP3基因的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了p7TP3基因的不同剪切體，對(duì)p7TP3基因組進(jìn)行分

2、析，確定了p7TP3剪切體1的編碼序列。為進(jìn)一步探討p7TP3剪切體1基因在HCV致病過(guò)程中的作用，我們進(jìn)行了如下研究： 1.采用RCR技術(shù)克隆擴(kuò)增p7TP3剪切體1，并以T-A克隆法，將p7TP3剪切體1基因片段連入載體pGEM-T，經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切鑒定以及測(cè)序分析，成功克隆了p7TP3剪切體1基因。 2.構(gòu)建熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-p7TP3剪切體1，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并以空載體pE

3、GFP-C1作為平行對(duì)照，檢測(cè)p7TP3剪切體1的細(xì)胞內(nèi)定位。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-p7TP3剪切體1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞漿中。 3.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-his-p7TP3剪切體1，以表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-his-p7TP3剪切體1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并以空載體pcDNA3.1/myc-his作為平行對(duì)照，制備轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解液，應(yīng)

4、用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建p7TP3剪切體1反式激活相關(guān)基因差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，篩選相關(guān)的靶基因片段，將產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)染E. coli大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，隨機(jī)挑選克隆，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序及同源性分析，篩選得到14種上調(diào)基因。 結(jié)果表明：(1)p7TP3剪切體1蛋白具有反式調(diào)節(jié)功能。(2)篩選得到的cDNA全長(zhǎng)序列，包括一些與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯合成、物質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡