抑制消減雜交技術(shù)在鯉魚抗寒研究中的應(yīng)用.pdf

1、魚類抗寒性狀是魚類的主要經(jīng)濟(jì)性狀之一。雖然國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其做了大量的研究，但至今對(duì)淡水魚類抗寒機(jī)理了解還很少。對(duì)于一些優(yōu)良的喜溫性魚類，特別是生長在北方溫帶水域的品種，如何克服分布水域的限制，成為魚類生物學(xué)家們面臨的巨大挑戰(zhàn)。近年來，通過眾多研究人員的不懈努力，魚類對(duì)環(huán)境適應(yīng)的相關(guān)研究已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展。同時(shí)，在探討魚類適應(yīng)環(huán)境溫度機(jī)理方面，如形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、生態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)等學(xué)科也取得了若干進(jìn)展，如對(duì)抗凍蛋白及其基因的

2、研究、分子標(biāo)記的應(yīng)用、細(xì)胞膜的流動(dòng)性、鈣離子泵的差異、酯類代謝的差別、同工酶的差異、血液及血清學(xué)生化指標(biāo)的變化、營養(yǎng)對(duì)魚類抗寒力的影響等。另外，很多研究表明，冷馴化下許多魚類基因的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，這些基因主要包括細(xì)胞色素c氧化酶、細(xì)胞色素P450、抗凍蛋白基因、肉毒堿軟脂轉(zhuǎn)移酶Ⅰ、CDC48、Wap65等。但是，抗寒的確切遺傳機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。 本文利用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)，對(duì)鯉魚(Cyprinuscarpio)抗

3、寒性狀相關(guān)的基因進(jìn)行了分析研究。通過對(duì)荷包紅鯉抗寒品系和柏氏鯉的雜交F2代進(jìn)行降溫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，獲得不同溫度下的實(shí)驗(yàn)材料。利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了各含有2000個(gè)克隆的正、反向消減cDNA文庫。并對(duì)其中480個(gè)克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交篩選，共得到60個(gè)陽性克隆，選取其中29個(gè)克隆進(jìn)行序列測定。通過序列分析比對(duì)，15個(gè)克隆與已知基因序列高度同源，同源性達(dá)到85％～98％，另外的14個(gè)克隆為未知新基因序列。與檢測克隆同源性較高的基因包括brevica

4、n基因、AMP-acid連接酶基因、CFL2基因、催產(chǎn)素基因、主要組織兼容復(fù)合體(MHC)Ⅱβ鏈、鋅指蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白多糖類、核受體/類視色素信號(hào)調(diào)節(jié)器、冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白、翻譯起始因子等。由此可見，鯉魚在低溫下由于受到冷刺激，其表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)可能會(huì)導(dǎo)致某些基因的開啟或關(guān)閉，從多個(gè)角度適應(yīng)周圍環(huán)境變化。神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)控在魚類抵抗低溫的過程中也發(fā)揮著重要作用，如RNA冷誘導(dǎo)結(jié)合蛋白(Cirp)、腦室

5、管膜蛋白(EPN)等的調(diào)控作用。EPN可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的再生，在魚體冷馴化過程中具有重要意義。另外，AMP-acid連接酶多用于脂類轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝過程，它可能參與了降溫過程中細(xì)胞膜的脂類代謝，并改變了膜脂的組成，以維持膜的流動(dòng)性和功能。這也表明，細(xì)胞膜的流動(dòng)性與抗寒的關(guān)系非常密切。 另外，將所建立的正、反向消減cDNA文庫中的所有菌落挑至硝酸纖維膜上，并用γ-32P標(biāo)記的放射性同位素探針(CA)15進(jìn)行雜交，篩選EST中的微衛(wèi)星序列

6、，共獲得了21個(gè)含有微衛(wèi)星的EST序列，其中核心序列為CA/GT的微衛(wèi)星序列占絕大多數(shù)，另外也觀測到GA、AT、CT等重復(fù)單元。利用PrimerPremier5.0對(duì)微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)了9對(duì)特異性引物，并進(jìn)行PCR檢測。通過EST-SSR對(duì)柏氏鯉與荷包紅鯉抗寒品系及其子代的分析表明，從EST中篩選到的微衛(wèi)星標(biāo)記與鯉魚的抗寒性狀或基因相關(guān)。并且，微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性(MI)，即基因組中簡單重復(fù)序列次數(shù)的增加或減少，也與基因的功能有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

7、，PCR擴(kuò)增得到的微衛(wèi)星片段核心序列重復(fù)次數(shù)小于134次(268/2)的子代不具備抗寒特性；而大于134次的個(gè)體具備抗寒能力。 根據(jù)魚類抗寒問題的研究現(xiàn)狀和今后發(fā)展趨勢，開展魚類抗寒基因的克隆鑒定及其耐寒機(jī)理研究，構(gòu)建適于抗寒分析的實(shí)驗(yàn)魚體系，篩選與抗寒功能相關(guān)的基因并研究其結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)理，將為水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類培育抗寒優(yōu)良品種提供大量的科學(xué)數(shù)據(jù)理論基礎(chǔ)，有利于提高我國魚類抗逆分子育種的研究水平及在國際魚類養(yǎng)殖上的地位，這