?；撬嵬ㄟ^PPARγ通路干預(yù)三氧化二砷引起的子代大鼠肝臟自噬性損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:慢性砷暴露與多種疾病有關(guān)，其中包括代謝性疾病。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一種核受體及配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于肝臟及脂質(zhì)含量豐富的器官中，起調(diào)節(jié)代謝的作用。在過去的研究中我們發(fā)現(xiàn)，砷可通過活性氧通路誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞(INS-1)的自噬性死亡。但慢性砷暴露對(duì)子代肝臟的損傷是否與自噬有關(guān)，以及砷引起的肝臟毒性是否與PPARγ相關(guān)聯(lián)尚不明確。?；撬崾且环N非必需氨基酸，主要存在于哺乳動(dòng)物肝臟中，具有抗氧化、參與代謝等

2、細(xì)胞保護(hù)作用。有研究表明牛磺酸可以減輕砷引起的動(dòng)物肝臟損傷，但其是否能防止砷引起的子代大鼠肝臟毒性及其是否通過PPARγ通路發(fā)揮干預(yù)作用尚不清楚。為了進(jìn)一步探討砷對(duì)子代大鼠的肝臟自噬性損傷機(jī)制及牛磺酸的保護(hù)作用，本研究擬探討三氧化二砷(As2O3)誘導(dǎo)大鼠肝臟細(xì)胞的自噬作用以及?；撬岬谋Ｗo(hù)作用機(jī)制。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為研究對(duì)象，孕鼠暴露于濃度為2 mg/kg BW～8mg/kg BW的As2O3，及150 mg/

3、kg BW濃度?；撬峁辔负螅M(jìn)行8 mg/kg BWAs2O3灌胃，至子代斷乳，后將子代大鼠繼續(xù)暴露于與母鼠相同劑量的As2O3至性成熟，共57天。測(cè)量子代大鼠的體重及肝臟重量;HE染色，觀察子代大鼠肝臟的形態(tài);用電子顯微鏡觀察子代大鼠肝臟細(xì)胞中自噬體的形成情況，計(jì)數(shù);用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)子代大鼠肝臟中PPARγ蛋白及自噬生物標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白及p62蛋白的表達(dá)情況;用RT-PCR方法檢測(cè)子代大鼠肝臟中PPAR

4、γ基因的表達(dá)情況。
　　為了進(jìn)一步研究砷的肝臟毒性及牛磺酸的保護(hù)作用，本研究以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，使其暴露于1μM的As2O3中24h后，利用RNA干擾技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因-5(Atg5)進(jìn)行RNA干擾，判斷As2O3引起的細(xì)胞自噬是否是造成細(xì)胞死亡的主要原因;并相應(yīng)用?；撬峒癙PAR激活劑羅格列酮預(yù)處理，用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率;用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中PPARγ及自噬相關(guān)蛋白LC3及p62的表達(dá)情況;

5、r>　　結(jié)果:暴露于不同濃度As2O3(2 mg/kg BW～8 mg/kg BW)后，子代大鼠的肝臟重量明顯增高，經(jīng)濃度為150 mg/kg BW?；撬峁辔负笤俦┞队? mg/kg BWAs2O3的子代大鼠肝臟的重量與8 mg/kg BW As2O3暴露組子代大鼠的肝臟臟器系數(shù)相比，明顯下降;HE染色結(jié)果顯示，隨著As2O3濃度的增加，子代大鼠肝臟細(xì)胞明顯縮小，在高暴露狀態(tài)出現(xiàn)水腫。而在牛磺酸保護(hù)組，子代大鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常;

6、電子顯微鏡下可見，As2O3暴露后，子代大鼠肝臟中有自噬體形成，其數(shù)量隨著As2O3濃度的升高而增多，?；撬岜Ｗo(hù)組自噬體增多不明顯;子代大鼠肝臟中LC3-II蛋白表達(dá)隨著As2O3濃度的升高而增加，p62蛋白的變化趨勢(shì)與其相反，?；撬岜Ｗo(hù)組LC3-II蛋白表達(dá)較8 mg/kg BW As2O3暴露組LC3-II蛋白的表達(dá)量減少，而p62蛋白表達(dá)增高;子代大鼠肝臟中PPARγ蛋白及基因的表達(dá)量隨著As2O3暴露劑量的升高而明顯減少，而在牛

7、磺酸保護(hù)組，其表達(dá)量較8 mg/kg BW As2O3暴露組蛋白表達(dá)量明顯上升。
　　經(jīng)過PPARγ激活劑預(yù)處理后，HepG2細(xì)胞的存活率明顯升高，PPARγ蛋白表達(dá)量明顯升高，提示PPARγ的抑制造成了As2O3引起的HepG2細(xì)胞自噬性死亡;經(jīng)過?；撬犷A(yù)處理后，PPARγ蛋白表達(dá)量明顯升高，且HepG2細(xì)胞存活率明顯升高，細(xì)胞的自噬得到了明顯抑制。
　　結(jié)論:As2O3可引起的子代大鼠肝臟自噬性損傷;PPARγ的抑制造成