自噬通過mTOR信號通路保護(hù)胃粘膜上皮細(xì)胞免于乙醇誘導(dǎo)的氧化損傷.pdf

1、第一部分乙醇抑制mTOR信號通路并誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞與組織自噬
　　目的：重建乙醇損傷胃粘膜上皮細(xì)胞與組織的模型，探索其中自噬的表達(dá)情況以及相關(guān)通路的調(diào)控作用與意義。
　　方法：胃粘膜上皮細(xì)胞系（GES-1細(xì)胞）與大鼠胃組織經(jīng)過不同濃度的乙醇干預(yù)后，通過MTT、流式細(xì)胞凋亡實驗、病理學(xué)評估等方法驗證細(xì)胞與組織的損傷情況，并采用Western blot、免疫熒光法與免疫組織化學(xué)法等技術(shù)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平并評估 mTOR

2、信號通路的調(diào)控情況，從而探索自噬在乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞中的分子機制。
　　結(jié)果：細(xì)胞實驗顯示乙醇干預(yù)可以抑制GES-1細(xì)胞增殖活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，動物實驗顯示大鼠經(jīng)乙醇灌胃處理后胃粘膜切片可見胃小凹破壞及粘膜出血。此外，Western blot結(jié)果顯示乙醇能上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與ATG12-ATG5的表達(dá)并促使LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化，而且這一過程伴隨著mTOR及其下游的p70S6激酶的去磷酸化。
　　

3、結(jié)論：乙醇誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞與組織損害，此外乙醇也可以通過抑制 mTOR信號通路誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞與組織自噬的產(chǎn)生。
　　第二部分調(diào)控細(xì)胞自噬對乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞與組織損傷的影響及相關(guān)機制
　　目的：探究乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞與組織的損傷與自噬之間的聯(lián)系以及作用機制。
　　方法：使用自噬抑制劑3-MA或采用Atg7-siRNA沉默自噬相關(guān)基因的方法抑制GES-1細(xì)胞自噬過程，乙醇干預(yù)后運用PCR或Western

4、 blot等技術(shù)測定自噬相關(guān)蛋白改變，采用MTT與流式細(xì)胞凋亡實驗等方法評估細(xì)胞增殖活性并檢測細(xì)胞凋亡過程；通過灌胃法使用自噬抑制劑CQ預(yù)處理大鼠胃粘膜，并經(jīng)乙醇干預(yù)后取胃組織做病理評分及H&E染色，評估胃粘膜的損傷情況，從而探討自噬在胃粘膜中的作用意義。
　　結(jié)果：細(xì)胞實驗中Western blot顯示抑制劑3-MA可以抑制GES-1細(xì)胞中LC3-II的生成，Atg7-siRNA可以通過沉默ATG7而抑制細(xì)胞自噬，MTT及流式凋

5、亡實驗數(shù)據(jù)顯示，相比于乙醇單獨干預(yù)，聯(lián)合3-MA或Atg7-siRNA增強乙醇對GES-1細(xì)胞損傷作用，即增殖活性更低且凋亡率更高；動物實驗結(jié)果顯示，與單用乙醇灌胃相比，使用CQ預(yù)處理可以增加乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷的病理評分以及更加嚴(yán)重的胃小凹損傷及粘膜出血。
　　結(jié)論：抑制細(xì)胞自噬可以增強乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞或組織損傷，提示自噬在胃粘膜上皮細(xì)胞或組織中的保護(hù)作用。
　　第三部分細(xì)胞自噬參與調(diào)控乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞與組

6、織氧化應(yīng)激
　　目的：探討胃粘膜上皮細(xì)胞與組織中乙醇所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與自噬之間的相互關(guān)系。
　　方法：乙醇與自噬抑制劑分別或聯(lián)合干預(yù)GES-1細(xì)胞后采用DCFH-DA孵育，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi) ROS的含量；乙醇或自噬抑制劑聯(lián)合或分別通過灌胃法飼喂大鼠，取胃粘膜組織勻漿后檢測其中SOD與MDA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：乙醇聯(lián)合自噬抑制劑干預(yù)GES-1細(xì)胞后DCF熒光強度明顯高于單用乙醇干預(yù)；乙醇聯(lián)合自噬抑制劑大鼠灌胃