MNP@CS-NADH的制備、特性及應(yīng)用.pdf

1、氧化還原酶占常見(jiàn)六大類酶的30％~35%，其中約80%為NAD(H)依賴型氧化還原酶。其在手性物質(zhì)生產(chǎn)、羥基酸與氨基酸制備、生物傳感器等方面均有重要應(yīng)用。本文制備了環(huán)氧基修飾的殼聚糖磁性納米粒子（MNP@CS-EPO），并用于固定化NADH得到磁性納米粒子固定化的輔酶（MNP@CS-NADH），進(jìn)而考察了 MNP@CS-NADH的反應(yīng)活性及其與不同種類酶的相互作用特性，最終將MNP@CS-NADH用于Lactobacillus reut

2、eri胞內(nèi)NADH依賴型氧化還原酶的快速分離。
　　首先，通過(guò)自組裝包覆及表面修飾獲得環(huán)氧基功能化的磁性納米粒子MNP@CS-EPO，進(jìn)而用于固定化 NADH獲得固定化的輔酶 MNP@CS-NADH。通過(guò)透射電鏡（TEM）形貌分析、紅外光譜分析（FTIR）、熱重分析（TG）、X射線衍射分析（XRD）、磁性能分析、zeta電位分析、形態(tài)觀測(cè)、沉降性能分析等對(duì)這兩種粒子分別進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示，MNP@CS-EPO表面具環(huán)氧基功能基團(tuán)

3、，在去離子水中和pH5~10的緩沖液中分散性良好，平均粒徑約10 nm，飽和磁化值為45.69 emu/g，具超順磁特性；MNP@CS-NADH在去離子水中及pH2~3、5~10的緩沖液中分散性良好，平均粒徑約10 nm，飽和磁化值為46.66 emu/g，并且在乳酸脫氫酶（LDH）催化過(guò)程中表現(xiàn)出反應(yīng)活性，且能在乙醇脫氫酶（ADH）和LDH偶聯(lián)體系中作為循環(huán)再生的輔酶，不斷催化反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，MNP@CS-NADH總轉(zhuǎn)化次數(shù)約為46.

4、8次。
　　其次，考察了時(shí)間和濃度對(duì) MNP@CS-EPO和MNP@CS-NADH分別用于固定化ADH的影響。結(jié)果顯示，ADH濃度為180μg/mL時(shí)，兩種粒子均達(dá)最大固定量26 mg/g粒子和44 mg/g粒子；MNP@CS-EPO和MNP@CS-NADH均能在1~2分鐘內(nèi)快速完成固定化；MNP@CS-ADH、MNP@CS-NADH~ADH與游離ADH的比活之比為1.81：1：7.44。這反映了兩種固定化方法中粒子與ADH作用方

5、式和作用位點(diǎn)的差異對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生不同的影響，進(jìn)而影響到酶的催化活性。
　　第三，為研究 MNP@CS-NADH對(duì)酶的選擇性相互作用，分別考察了MNP@CS-NADH與蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）和NADH依賴型氧化還原酶（ADH）的相互作用。結(jié)果顯示，MNP@CS-NADH與ADH作用遠(yuǎn)高于蔗糖轉(zhuǎn)化酶，在ADH和INV的混合蛋白中 MNP@CS-NADH可選擇性親和吸附 ADH；對(duì)MNP@CS-NADH~ADH表面ADH的脫附研究表

6、明，pH、底物和NADH均能調(diào)控ADH的解吸，pH調(diào)控最簡(jiǎn)便，且蛋白和酶活解析率最大，分別為35.25%和31.51%。因此該方法可從混合蛋白中選擇性吸附NADH依賴型氧化還原酶，并能有效脫附。
　　最后，將固定化輔酶MNP@CS-NADH用于分離純化L. reuteri胞內(nèi)NADH依賴型氧化還原酶。結(jié)果表面，MNP@CS-NADH可直接從細(xì)胞破碎液中分離濃縮 NADH依賴型氧化還原酶，其中 LDH純化倍數(shù)約為8.15，酶活回收率