NADH再生系統(tǒng)的共建及石油降解酶制劑的制備.pdf

1、在石油的開采、存儲、精煉以及之后的使用過程中不可避免的會產生一些泄漏和排放，從而對環(huán)境造成很大的破壞，導致土壤和地下水的嚴重污染，此外，這些污染對生物也同樣具有很大的毒性。利用自然界中的微生物的代謝過程對石油烴的降解是目前來說最為有效的修復方式。而生物降解的本質是生物體內降解酶對石油烴分子的酶促降解，將微生物的細胞進行細胞破碎，從中提取石油烴降解酶，直接應用于石油烴的降解，可以避開石油烴分子從胞外到胞內的運輸過程，提高石油烴的降解效率。

2、
　　本文通過表達來自博伊丁假絲酵母菌中的甲酸脫氫酶（NADH再生系統(tǒng)）并與石油降解酶進行共固定，構建石油降解及NADH再生的偶聯(lián)系統(tǒng)，利用甲酸/甲酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)可以為石油烴降解酶連續(xù)提供還原態(tài)NADH，實現(xiàn)石油酶降解及NADH再生的偶聯(lián)，降低石油烴降解酶的使用成本；研究該系統(tǒng)的構建及石油降解特性，主要研究內容及結論如下：
　?。?）首先提取了博伊丁假絲酵母菌（C.boidinii）的基因組，PCR擴增了NAD+依賴性

3、的甲酸脫氫酶的基因（fdh），并對博伊丁假絲酵母菌的fdh基因進行了序列分析；
　?。?）將fdh基因連接到載體pET28a(+)中，構建了質粒pET28a(+)-fdh，轉化大腸桿菌 BL21(DE3)，構建完成表達 fdh的大腸桿菌菌株 E.coli E.coli BL21（pET28a(+)-fdh）。
　?。?）培養(yǎng)E.coli BL21（pET28a(+)-fdh），轉接2h之后進行誘導，添加終濃度為1 mmol/

4、L的IPTG進行誘導，離心收集菌體、破碎，測定酶活性，結果顯示當破碎功率為300W、破碎\間隔時間為2s\2s、工作總時間10min時，每克菌體得到的酶活性為1.19U；
　　（4）將石油降解酶與FDH進行共固定，在每克硅藻土固定2mg石油降解酶的情況下，當甲酸脫氫酶的添加量為0.06 U·g-1時，固定化酶的催化活性最高；
　?。?）將石油降解酶與 FDH進行共固定。當石油降解酶2mg、甲酸脫氫酶0.06 U、甲酸鈉0.1