抗葉酸代謝藥MTX誘導神經(jīng)管畸形動物模型及其對基因組穩(wěn)定性的影響.pdf

1、目的1、利用抗葉酸代謝藥MTX 建立神經(jīng)管畸形小鼠模型。2、研究MTX 誘導神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)組織基因組拷貝數(shù)變異以及甲基化的改變。3、觀察MTX 抑制葉酸代謝對神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)上皮細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法1、甲氨蝶呤誘導神經(jīng)管畸形小鼠模型的建立C57BL/6 孕鼠在懷孕第7.5天腹腔注射不同劑量的MTX，懷孕第11.5天處死孕鼠，體視顯微鏡下取出胚胎，觀察其發(fā)育情況，記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、畸形胎數(shù)，

2、計算畸形率，逐一測量胚胎的體長和體重。將部分正常胚胎和神經(jīng)管畸形胚胎固定于10％中性福爾馬林中。取出固定的全胚胎組織，進行石蠟包埋，連續(xù)切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察。根據(jù)實驗結(jié)果篩選最佳造模劑量。2、微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測MTX 誘導神經(jīng)管畸形胚胎神經(jīng)組織基因組拷貝數(shù)變異（CNV）應用高分辨微陣列比較基因組雜交技術(shù)（aCGH）檢測正常和神經(jīng)管畸形胚胎基因組CNV，設定log2 ratio means?0.45；CNvs探針密

3、度?5；長度?10Kb為高可信度CNV 標準篩選CNV。并聯(lián)合RT-PCR和MassARRAY平臺對高可信度CNV 進行驗證，用GO對位于高可信度CNV上的基因進行注釋，篩選候選基因。3、全基因組甲基化芯片檢測MTX 誘導神經(jīng)管畸形胚胎神經(jīng)組織基因組甲基化的改變應用全基因組甲基化芯片檢測正常和神經(jīng)管畸形胚胎基因組甲基化的改變。設定peak同時在3個神經(jīng)管畸形樣品都發(fā)生改變，且peak的log2 ratio means?0.5為標準篩選高

4、可信度peak，即發(fā)生甲基化改變的區(qū)域，并對發(fā)生甲基化改變的基因進行GO分析，同時用RT-PCR（reverse transcription PCR）方法觀察候選基因的表達情況。4、MTX 抑制葉酸代謝對神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)上皮細胞增殖和凋亡的影響應用TUNEL 方法觀察神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)管上皮細胞的凋亡情況。應用免疫組化的方法觀察pH3蛋白在神經(jīng)管上皮細胞的表達，從而反映細胞的增殖情況。應用免疫組化和western-blotti

5、ng的方法檢測小鼠胚胎腦caspase3的表達情況。
　　 結(jié)果1、成功建立了葉酸代謝障礙的神經(jīng)管畸形動物模型，C57BL/6 孕鼠在懷孕第7.5天腹腔注射4.5mg/kg 體重MTX為最佳造模方案，神經(jīng)管畸形的發(fā)生率為31.4％。小鼠胚胎組織的DHFR 活性在注射MTX4.5mg/kg 體重4～8小時后降到最低，12小時以后開始恢復，但是仍然低于注射前。小鼠全胚胎連續(xù)切片HE 染色結(jié)果顯示，神經(jīng)管畸形多數(shù)表現(xiàn)為神經(jīng)管后腦未閉合

6、畸形，少數(shù)表現(xiàn)為神經(jīng)管全腦未閉合畸形，顱脊柱裂等。2、與正常胚胎相比，NTDs小鼠胚胎gDNA 缺失的片段共12個。主要在7 號、9 號、11號以及X 染色體。缺失長度從5Kb-18Mb不等；擴增的片段共9個，均位于6 號染色體，長度在3Kb-5Kb不等。進行高可信度標準篩選后，3個CNV 被認為是高可信度CNV，且這3個CNV 均位于X 染色體，對這3個CNV 進行驗證以后證實這3個片段拷貝數(shù)缺失。GO 結(jié)果顯示位于這3個CNVs上所

7、有的103個基因中，參與細胞代謝過程的基因數(shù)量最多，有25個。參與其他生物學過程還包括：物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、細胞周期等等。3、與正常胚胎相比，3個NTDs小鼠胚胎共同發(fā)生低甲基化的區(qū)域有35個，3個NTDs小鼠胚胎共同發(fā)生高甲基化的區(qū)域有97個，進行高可信度篩選以后，26個區(qū)域被認為具有高可信度，驚奇地是，這26個區(qū)域均位于X 染色體，并且在NTDs小鼠胚胎都為低甲基化。這些區(qū)域大多數(shù)位于基因的啟動子區(qū)（promoter），少

8、數(shù)位于基因內(nèi)（within），或者基因的上下游（left、right），基因注釋后結(jié)果顯示，這些區(qū)域影響到的基因共30個，其中3個基因是同時發(fā)生了CNV 缺失和低甲基化，這3個基因分別為Ebp、Otud5、Maoa。4、TUNEL和pH3免疫組化結(jié)果顯示：與正常對照組相比，NTD小鼠胚胎神經(jīng)上皮細胞增殖減少（P<0.05），凋亡增加（P<0.05）；與正常組相比，caspase 3在腦的表達增加（P<0.05）。
　　 結(jié)論1、

9、本研究應用抗葉酸代謝藥MTX 抑制了小鼠胚胎葉酸代謝通路，成功建立了神經(jīng)管畸形的小鼠模型，進一步證實了葉酸缺乏及其相關代謝障礙與神經(jīng)管畸形的密切關系。2、MTX通過抑制小鼠胚胎的葉酸代謝通路，引起小鼠胚胎基因組發(fā)生拷貝數(shù)變異以及甲基化的改變，導致基因組的不穩(wěn)定性，其中對X 染色體的影響最大。葉酸代謝障礙所導致的基因組的不穩(wěn)定性可能是神經(jīng)管畸形發(fā)生的分子機制。3、神經(jīng)管畸形小鼠神經(jīng)上皮細胞增殖減少、凋亡增加。增殖減少可能是由于DNA/RN