miR-27a-335通過(guò)靶向HOXC6增強(qiáng)NSCLC吉非替尼敏感性及其機(jī)制研究.pdf

1、目前，NSCLC的一線化療方案包括基于鉑類的聯(lián)合療法和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)等小分子靶向藥物治療。吉非替尼（Gefitinib，Gef），作為EGFR-TKIs的代表性藥物，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，尤其是在非吸煙人群和亞洲患者上展現(xiàn)出良好的療效，為晚期NSCLC患者帶來(lái)希望的曙光。然而，EGFR-TKIs治療后出現(xiàn)的獲得性耐藥導(dǎo)致患者治療失敗

2、，極大地阻礙了其應(yīng)用。獲得性耐藥是造成Gef等EGFR TKIs治療NSCLC不良預(yù)后的關(guān)鍵因素，探索其機(jī)制以解決耐藥問(wèn)題，進(jìn)而改善患者的生存狀況迫在眉睫。
　　同源異形盒基因（Homeobox genes，HOX基因）是一類進(jìn)化上高度保守的基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育中控制細(xì)胞生長(zhǎng)和組織分化。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HOX基因可通過(guò)調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的自我更新與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期和侵襲遷移等過(guò)程發(fā)揮促癌或抑癌作用，一些HOX

3、基因還被證實(shí)參與了腫瘤耐藥。HOXC6作為HOX家族重要成員之一，被證實(shí)在多種腫瘤中異常表達(dá)，并可作為惡性腫瘤預(yù)測(cè)及預(yù)后的良好生物標(biāo)志物。然而，HOXC6在NSCLC腫瘤發(fā)生和發(fā)展中所起的作用如何，其在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中扮演怎樣的角色，相關(guān)研究甚少。
　　microRNA為一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過(guò)作用于相應(yīng)靶mRNA，參與并控制與腫瘤細(xì)胞存亡相關(guān)的多種細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展并調(diào)控腫瘤耐藥

4、。近年來(lái)，許多miRNAs被報(bào)道在肺癌發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中以及調(diào)節(jié)抗腫瘤治療（尤其是EGFR-TKIs）的應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。miR-27a和miR-335在胃癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中異常表達(dá)，然而，有關(guān)miR-27a或miR-335在NSCLC中的表達(dá)情況及意義，迄今尚不清楚。此外，研究發(fā)現(xiàn)，HOX基因表達(dá)也受到多種miRNAs的靶向調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展及腫瘤耐藥。
　　本研究旨在探討HOXC6在NSCLC G

5、ef敏感性中的作用及其機(jī)制，并進(jìn)一步探究miR-27a/miR-335與HOXC6的靶標(biāo)關(guān)系及其對(duì)NSCLC Gef敏感性的影響，以期為NSCLC藥物治療提供新的分子干預(yù)靶點(diǎn)，并為臨床上逆轉(zhuǎn)耐藥的治療策略提供新的參考。本研究分以下兩個(gè)部分：
　　第一部分：HOXC6對(duì)NSCLC吉非替尼敏感性的影響及其機(jī)制
　　目的：探究HOXC6在NSCLC的表達(dá)情況及在Gef耐藥中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：1）通過(guò)免疫組化技術(shù)

6、（IHC）檢測(cè)93例NSCLC組織芯片中HOXC6的表達(dá)情況，并分析HOXC6表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征及生存期的關(guān)系。2）qRT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)NSCLC Gef敏感株（PC9，HCC827）和耐藥株（PC9/G，H1299，A549，H1975）中HOXC6的mRNA和蛋白表達(dá)水平。3）在PC9/G細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HOXC6siRNA后，Western blot檢測(cè)HOXC6蛋白的表達(dá)變化；CCK-8法檢

7、測(cè)細(xì)胞對(duì)Gef敏感性的變化，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gef對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gef對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，Transwell檢測(cè)Gef對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：1）HOXC6在NSCLC癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為98.92％和7.01%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HOXC6在NSCLC癌組織中的IHC評(píng)分顯著高于其在癌旁組織中的評(píng)分；HOXC6高表達(dá)與年齡（P=0.015）、淋巴結(jié)侵襲（P=0.00

8、5）及TNM臨床分期（P=0.007）顯著相關(guān)，而與其他因素?zé)o關(guān)；Kaplan-Meier分析顯示，HOXC6低表達(dá)的NSCLC患者的總生存期優(yōu)于HOXC6高表達(dá)患者，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.043）。2）與NSCLC Gef敏感株（PC9，HCC827）相比，NSCLC Gef耐藥株（PC9/G，H1299，A549，H1975）中HOXC6的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05；P＜0.05）。3）C9/G細(xì)胞轉(zhuǎn)染HO

9、XC6siRNA后，HOXC6表達(dá)呈劑量依賴性降低；HOXC6沉默后，C9/G對(duì)Gef的敏感性增強(qiáng)，Gef對(duì)PC9/G細(xì)胞活力和克隆形成能力的抑制明顯增強(qiáng)（P＜0.01，P＜0.001），Gef誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.001），細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯的比例顯著提高（P＜0.001），Gef對(duì)PC9/G細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用明顯增強(qiáng)（P＜0.001，P＜0.001）。
　　結(jié)論：1）HOXC6在NSCLC癌組織中高表達(dá)

10、，可能參與NSCLC發(fā)生發(fā)展并影響患者生存期。2）HOXC6在NSCLC Gef耐藥株中表達(dá)增加，HOXC6沉默可能是通過(guò)上調(diào)Bim，下調(diào)Survivin和Bcl-2促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡；調(diào)節(jié)Cyclin B1和Cyclin D1誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期；抑制Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移；調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族蛋白影響藥物的蓄積和釋放，從而增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對(duì)Gef的敏感性。本部分研究闡明了HOXC6在

11、NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用以及對(duì)Gef耐藥的影響及機(jī)制，有助于增進(jìn)我們對(duì)NSCLC疾病進(jìn)展及Gef耐藥機(jī)制的理解。
　　第二部分：miR-27a/miR-335通過(guò)靶向HOXC6增強(qiáng)NSCLC吉非替尼敏感性
　　目的：探究miR-27a/miR-335與HOXC6的靶標(biāo)關(guān)系，以及miR-27a/miR-335在NSCLC Gef敏感性中的作用。
　　方法：1）通過(guò)TargetScan等生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)可靶向調(diào)節(jié)

12、HOXC6的miRNAs；在PC9/G細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同miRNA mimics，Western blot法篩選可顯著調(diào)節(jié)HOXC6表達(dá)的miRNAs；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-27a是否作用于HOXC6mRNA的3’-UTR區(qū)預(yù)測(cè)靶位。2）在PC9/G細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-27a/miR-335mimics或共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOXC6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)Gef敏感性的變化。轉(zhuǎn)染miR-27a/miR-335mi

13、mics后，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gef對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gef對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響；Transwell檢測(cè)Gef對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。3）建立PC9/G細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型（共30只）后，隨機(jī)分為以下六組（每組5只）：miR-NC對(duì)照組、miR-27a組、miR-335組、miR-NC+Gef組、miR-27a+Gef組、miR-335+Gef組，分別用相應(yīng)藥物（多點(diǎn)瘤內(nèi)注射miR-27a/miR-335Ag

14、omir，灌胃給予Gef）干預(yù)3周，檢測(cè)miR-27a/miR-335Agomir單用或聯(lián)合Gef給藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響；給藥結(jié)束后，處死裸鼠，取腫瘤組織固定并進(jìn)行石蠟包埋，H&E染色檢測(cè)腫瘤組織形態(tài)變化，IHC法測(cè)定移植瘤內(nèi)Ki-67、HOXC6表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1）通過(guò)TargetScan等生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)可靶向調(diào)節(jié)HOXC6的miRNAs，并經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-27a和miR-335可劑量依賴性地

15、下調(diào)HOXC6表達(dá)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-27a mimics可明顯抑制野生型HOXC63’-UTR報(bào)告基因熒光素酶活性（P＜0.01），但不抑制突變型報(bào)告基因熒光素酶的熒光活性；HOXC6的3’-UTR區(qū)不存在miR-335的結(jié)合位點(diǎn)。2）PC9/G細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27a或miR-335mimics后，Gef對(duì)PC9/G細(xì)胞活力和克隆形成能力的抑制明顯增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01；P＜0.01，P＜0.001），共轉(zhuǎn)

16、染pcDNA3.1-HOXC6可抑制miR-27a/miR-335對(duì)Gef的增敏效果（P＜0.05，P＜0.01）。此外，miR-27a和miR-335過(guò)表達(dá)可使Gef誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.001，P＜0.01），G2/M期阻滯的細(xì)胞比例顯著提高（P＜0.01，P＜0.001），Gef對(duì)PC9/G細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制明顯增強(qiáng)（P＜0.001，P＜0.001；P＜0.01，P＜0.001）。3）miR-27a或miR-335

17、Agomir均可顯著增強(qiáng)Gef對(duì)移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制（P＜0.001，P＜0.001）。免疫組化HOXC6染色結(jié)果顯示，miR-27a和miR-335Agomir單用及聯(lián)合Gef組HOXC6的表達(dá)均明顯降低。H&E染色和Ki-67染色結(jié)果表明，miR-27a和miR-335Agomir可增強(qiáng)Gef對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制。
　　結(jié)論：1）miR-27a直接靶向HOXC6啟動(dòng)子3’-UTR區(qū)，miR-335間接靶向HOXC6，二者均

18、可顯著下調(diào)HOXC6表達(dá)；2）miR-27a或miR-335過(guò)表達(dá)可通過(guò)增強(qiáng)Gef誘導(dǎo)的PC9/G細(xì)胞凋亡、周期阻滯、遷移和侵襲抑制，增強(qiáng)PC9/G對(duì)Gef敏感性；3）miR-27a或miR-335可通過(guò)抑制HOXC6的表達(dá)，增強(qiáng)Gef對(duì)移植瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制。4）miR-27a和miR-335在NSCLC組織中低表達(dá)，可能影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展及患者生存期。本部分研究闡明了miR-27a/miR-335對(duì)HOXC6的靶向調(diào)節(jié)作用及