天然藥物金納多誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)向分化的濃度優(yōu)化條件研究.pdf

1、目的：觀察金納多注射液能否在體外促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(humanadipose-derivedstemcells，hADSCs)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并探索其安全、有效的最佳誘導(dǎo)濃度，使這種為人熟知的良藥有望在新的干細(xì)胞領(lǐng)域?yàn)槿祟惿窠?jīng)損傷或退行性疾病的治療發(fā)揮更重要的作用。
　　 方法：本研究分為兩部分進(jìn)行:(1)采用消化法分離純化hADSCs，通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)hADSCs的表面抗原(CD13，CD34

2、，CD45，CD90，CD106)，檢測(cè)hADSCs體外成脂肪、成骨分化能力的方法，對(duì)hADSCs進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行體外培養(yǎng)及擴(kuò)增。(2)配制含金納多藥物濃度分別為0.3、0.6、1.3、1.9和2.6g/L的5組含藥培養(yǎng)基和不含藥正常培養(yǎng)基，分別對(duì)hADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡下觀察不同藥物濃度在不同時(shí)間點(diǎn)作用于細(xì)胞的形態(tài)變化，誘導(dǎo)至第14d時(shí)采用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元骨架蛋白微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-asso

3、ciatedprotein2，MAP-2)、神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growthassociatedprotein-43，GAP-43)、突觸功能蛋白突觸素(synaptophysin，Syn)、神經(jīng)細(xì)胞功能活性的形態(tài)指標(biāo)尼氏小體(NisslBody)的表達(dá)情況;MTT法檢測(cè)0.3-2.6g/L之間8組濃度的金納多對(duì)hADSCs作用后的細(xì)胞活性曲線;確定金納多是否具有神經(jīng)向誘導(dǎo)作用及其發(fā)揮作用的安全濃度范圍。優(yōu)化濃度條件，選擇1.6g/

4、L濃度組為主要對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證。流式細(xì)胞儀檢測(cè)1.3-2.6g/L之間4組濃度的金納多對(duì)hADSCs細(xì)胞凋亡率的影響，倒置顯微鏡下觀察在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的形態(tài)變化，分別于誘導(dǎo)后第3d、7d、10d、14d、21d采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞特異性標(biāo)記物神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、MAP-2、GAP-43、Syn、Nissl和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GF

5、AP)的表達(dá)情況，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。
　　 結(jié)果：(1)體外分離培養(yǎng)的hADSCs穩(wěn)定傳代后形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀生長(zhǎng)，可穩(wěn)定擴(kuò)增15代以上并高表達(dá)ADSCs表面抗原CD90、CD13，而淋巴和造血系細(xì)胞標(biāo)志CD34，、CD45、CD106均呈低表達(dá);成脂肪誘導(dǎo)30d后可見脂滴生成，成骨誘導(dǎo)30d后可見礦化結(jié)節(jié)形成;所提取和培養(yǎng)的細(xì)胞可鑒定為hADSCs。(2)經(jīng)金納多低濃度(0.3g/L、0.6g/L、1.3g/L)組誘導(dǎo)后的hA

6、DSCs形態(tài)在短暫的神經(jīng)元樣形態(tài)改變后，恢復(fù)至原長(zhǎng)梭形形態(tài);高濃度(1.9g/L、2.6g/L)組誘導(dǎo)后的hADSCs具有神經(jīng)元的典型形態(tài)并可保持穩(wěn)定。誘導(dǎo)后14d神經(jīng)標(biāo)記物染色結(jié)果顯示:低濃度(0.3g/L、0.6g/L、1.3g/L)組各個(gè)標(biāo)記物表達(dá)均為陰性;高濃度(1.9g/L、2.6g/L)組各標(biāo)記物也均呈陽(yáng)性表達(dá)，但細(xì)胞稀少。MTT法檢測(cè)金納多作用后hADSCs細(xì)胞活性曲線顯示:低濃度(0.3g/L-1.6g/L)組細(xì)胞活性與

7、對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＜0.05)，各組間相比無(wú)差異性(P＞0.05);高濃度(1.9g/L-2.6g/L)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，各組間相比無(wú)差異性（P＞0.05）;低濃度組與高濃度組各組間相比均有顯著性差異(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率顯示:1.6g/L組活性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相差不大;1.9g/L組細(xì)胞活性明顯降低，并于誘導(dǎo)后第3天開始凋亡。結(jié)果說(shuō)明高濃度組顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，甚至誘導(dǎo)其凋

8、亡;由以上結(jié)果確定金納多發(fā)揮其誘導(dǎo)作用的有效、安全濃度范圍為1.3g/L＜X＜1.9g/L。優(yōu)化選取1.6g/L濃度組進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)1.6g/L組可誘導(dǎo)hADSCs呈現(xiàn)并穩(wěn)定保持典型神經(jīng)元形態(tài)，即細(xì)胞呈雙極或多極、并有突觸樣結(jié)構(gòu)形成并在細(xì)胞間構(gòu)成類似神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀連接。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，1.6g/L濃度組在整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中均持續(xù)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物Nestin、MAP-2、Syn、GAP-43、Nissl，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP僅

9、有短暫微弱表達(dá)。
　　 結(jié)論：(1)金納多作為單一誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)hADSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，不促進(jìn)向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，且其誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性;(2)低濃度(1.3g/L及其以下)對(duì)hADSCs生長(zhǎng)活性和神經(jīng)向分化均無(wú)明顯影響;(3)高濃度(1.9g/L及其以上)對(duì)hADSCs可發(fā)揮神經(jīng)向誘導(dǎo)作用，但明顯抑制其生長(zhǎng)活性，隨著濃度的增高甚至促進(jìn)其凋亡;(4)1.6g/L濃度的金納多可穩(wěn)定誘導(dǎo)hADSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，同時(shí)