胃Lgr5陽性干細(xì)胞是胃癌的細(xì)胞起源.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，2012年胃癌的發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第5位，癌癥死亡率居第3位。近年來研究人員利用基因敲除技術(shù)揭示了多種分子在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。但是，由于之前研究所利用的胃癌小鼠模型是在全體細(xì)胞或者胃粘膜全層上皮細(xì)胞發(fā)生突變，無法明確胃癌發(fā)生的起始細(xì)胞究竟是哪種特定的細(xì)胞類型。所以，胃癌的細(xì)胞起源一直是該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)科學(xué)問題。理論上來說，組織干細(xì)胞由于其持續(xù)的自我更新和長期存活

2、的特性可能比分化成熟的細(xì)胞更易于成為腫瘤的起始細(xì)胞。但由于一直以來缺乏明確的分子標(biāo)志物，胃組織干細(xì)胞的異常是否能夠?qū)е挛赴┑陌l(fā)生缺乏直接的體內(nèi)證據(jù)。2010年研究報(bào)道了第一個(gè)胃竇及胃-食管（小鼠對(duì)應(yīng)的解剖結(jié)構(gòu)是腺胃-前胃/食管）交接處的干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr5，但關(guān)于胃Lgr5+組織干細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用還存在著爭議。之前的研究表明，胃Lgr5+干細(xì)胞的異常僅能導(dǎo)致微腺瘤或者良性的腺瘤，而不能導(dǎo)致惡性胃癌的發(fā)生。另外，一些臨床的數(shù)據(jù)發(fā)

3、現(xiàn)胃癌樣本中存在Lgr5+的腫瘤細(xì)胞或者Lgr5的高表達(dá)，但也有一些臨床研究發(fā)現(xiàn)Lgr5+細(xì)胞在胃癌早期缺如，進(jìn)一步質(zhì)疑了胃Lgr5+組織干細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　所以，我們提出了以下的科學(xué)問題：1）胃Lgr5+干細(xì)胞是否是胃癌的細(xì)胞起源；2）胃Lgr5+干細(xì)胞是否比分化細(xì)胞更容易起始胃癌發(fā)生；3）人胃癌樣本中LGR5的表達(dá)及信號(hào)通路的失調(diào)如何？
　　為了解決以上的科學(xué)問題，我們利用條件基因打靶技術(shù)在胃竇及胃-食管

4、交接處的Lgr5+干細(xì)胞中特異性地對(duì)TGF-β、Akt、Wnt和Kras等腫瘤相關(guān)重要信號(hào)通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行誘導(dǎo)修飾，并結(jié)合體內(nèi)的細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)，考察Lgr5+組織干細(xì)胞是否能夠作為胃癌的細(xì)胞起源，分析腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中干細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)維持、動(dòng)員及其分化等的變化以及腫瘤中相關(guān)的分子和信號(hào)通路的改變，明確Lgr5+組織干細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。通過對(duì)三種分化成熟的細(xì)胞進(jìn)行相同的基因改變，進(jìn)一步分析胃Lgr5+干細(xì)胞是否比分化細(xì)

5、胞更容易起始胃癌的發(fā)生。最后結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中大規(guī)模的人胃癌樣本進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確胃組織干細(xì)胞是否與人胃癌的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。
　　胃竇Lgr5+干細(xì)胞中特異性地敲除Smad4和PTEN導(dǎo)致65％（13/20）的小鼠在誘導(dǎo)后三個(gè)月內(nèi)發(fā)生腺瘤，40%（8/20）發(fā)生浸潤性的腸型腺癌。腫瘤細(xì)胞增殖旺盛且失去了分化成熟的能力。進(jìn)一步分析腫瘤發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路的改變，我們發(fā)現(xiàn)Smad4下游靶分子中與增殖密切相關(guān)的cyclin D1以及與轉(zhuǎn)

6、移密切相關(guān)的Spp1的表達(dá)明顯升高，與增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)的MAPK、EGFR、Stat3等信號(hào)通路異常激活。接下來我們考察Smad4和PTEN的缺失對(duì)胃竇干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙基因的缺失不影響胃竇Lgr5+干細(xì)胞的數(shù)目，但導(dǎo)致前體細(xì)胞增多并抑制其向子代細(xì)胞的分化，提示來自突變的Lgr5+干細(xì)胞的增殖細(xì)胞主要貢獻(xiàn)了腫瘤早期的細(xì)胞構(gòu)成。在胃癌進(jìn)展過程中，我們發(fā)現(xiàn)在腺瘤以及腺癌的粘膜區(qū)Lgr5的表達(dá)依然位于底部，這與正常胃竇中Lgr5

7、的表達(dá)譜相似。令人驚訝的是，在腺癌的浸潤區(qū)Lgr5+腫瘤細(xì)胞廣泛散在性分布、增殖旺盛并高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)記物 CD44，提示我們 Lgr5+細(xì)胞可能促進(jìn)胃癌的惡性轉(zhuǎn)化以及浸潤。另外在胃-食管交接處的Lgr5+干細(xì)胞中敲除 Smad4和PTEN也能夠?qū)е?5%的小鼠發(fā)生浸潤性的腺癌。此外，胃竇Lgr5+干細(xì)胞中敲除Smad4和p53的同時(shí)激活Kras也能夠?qū)е滦∈蟀l(fā)生腺瘤。這些結(jié)果證明突變的Lgr5+干細(xì)胞能夠起始胃癌的發(fā)生。

8、>　　接下來，我們考察胃Lgr5+干細(xì)胞是否比分化細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生。我們選取了兩種由Lgr5+干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃竇的頂細(xì)胞及胃體胃竇轉(zhuǎn)換區(qū)的壁細(xì)胞中特異性地敲除Smad4和PTEN，在同樣的時(shí)間內(nèi)都不能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。另外胃體小彎處存在著一群Lgr5標(biāo)記的分化成熟的主細(xì)胞，相同的遺傳背景條件下 Lgr5+的主細(xì)胞同樣不能起始胃癌的發(fā)生，證明胃 Lgr5+干細(xì)胞比分化成熟的細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生。
　　最后

9、，我們結(jié)合 TCGA數(shù)據(jù)庫中大規(guī)模的人胃癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LGR5在胃竇以及胃-食管交接處的腸型胃癌中的表達(dá)均明顯升高。此外，56%（61/109）的人腸型胃癌樣本中 SMAD4出現(xiàn)缺失和突變，33%（36/109）的人腸型胃癌樣本中PTEN出現(xiàn)缺失和突變。SMAD4和PTEN基因的缺失直接導(dǎo)致了其RNA和蛋白表達(dá)的下降，并進(jìn)一步導(dǎo)致了 SMAD4和 PTEN下游信號(hào)通路的失調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SMAD4和PTEN在基因上的缺失

10、更傾向于同時(shí)發(fā)生，而且導(dǎo)致了其RNA表達(dá)的協(xié)同下降，提示SMAD4和PTEN可能能夠協(xié)同抑制人類胃癌的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果都表明，人胃癌樣本常伴LGR5的高表達(dá)以及SMAD4和PTEN信號(hào)通路的失調(diào)，與我們小鼠中得到的結(jié)果相一致，進(jìn)一步提示人類中LGR5+干細(xì)胞中缺失SMAD4和PTEN也可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。
　　綜上所述，本課題結(jié)論及原創(chuàng)性主要包括以下三點(diǎn)：1）證實(shí)胃Lgr5+干細(xì)胞是浸潤性腸型胃癌的細(xì)胞起源。我們利用條件基因打靶

11、技術(shù)在小鼠成體胃竇和胃-食管交接處的Lgr5+干細(xì)胞中特異性敲除Smad4和PTEN，在誘導(dǎo)3個(gè)月內(nèi)小鼠逐步發(fā)生微腺瘤、腺瘤以及浸潤性腺癌。2）證實(shí)了胃Lgr5+干細(xì)胞比分化細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生；3）在大規(guī)模的人胃癌樣本中發(fā)現(xiàn)LGR5的高表達(dá)，而且常伴SMAD4和PTEN基因的協(xié)同缺失及其下游信號(hào)通路的失調(diào)。
　　本研究為理解人類胃癌發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制及分子機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)。此外， Lgr5+干細(xì)胞不僅作為胃癌的起始細(xì)胞，還可