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文檔簡介
1、目的:克隆廣西瑤山亞種樹鼩Toll樣受體3(Toll like receptor3,TLR3)基因的開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF)序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF的原核表達(dá)載體,原核表達(dá)廣西瑤山亞種樹鼩Toll樣受體3重組蛋白。
方法:(1)參照滇西亞種TLR3 mRNA預(yù)測序列,用Vector NTI分析其ORF,并應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0
2、針對樹鼩TLR3基因序列設(shè)計(jì)引物,且以廣西瑤山亞種樹鼩外周血總RNA為模板合成第一鏈cDNA。(2)設(shè)計(jì)九條特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增得到目的片段,與融合表達(dá)載體PBET-4連接。將重組質(zhì)粒PBET-4-TLR3 ORF轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,用含Amp的LB培養(yǎng)基篩出單克隆菌落,菌落PCR鑒定重組克隆分子量大小。(3)送測序,通過基因比對分析廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列和預(yù)測滇西亞種樹鼩TLR3基因ORF序列的同源性,并對廣西瑤山亞種
3、樹鼩TLR3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(4)提取重組質(zhì)粒PBET-4-TLR3 ORF,將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株DE3中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白變性后,制SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳,考馬斯亮藍(lán)染色再脫色,分析廣西瑤山亞種樹鼩Toll樣受體3重組蛋白表達(dá)情況。
(5)采用DNAMAN軟件對克隆得到的廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列進(jìn)行基因序列分析;用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具對廣西瑤山亞種樹鼩與其他物種的TLR3基因OR
4、F序列的進(jìn)行同源性分析。采用Vector NTI軟件對廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測,并對廣西瑤山亞種樹鼩與滇西亞種樹鼩的TLR3基因ORF序列和氨基酸序列進(jìn)行比對;通過軟件MEGA5.10繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹;使用(http://web.expasy.org/protscale/)在線軟件預(yù)測廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白的疏水性;使用(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預(yù)測廣西瑤山亞
5、種樹鼩TLR3蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;用在線分析工具NetPhos2.0 Server對廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。
結(jié)果:(1)經(jīng)測序及綜合分析表明,構(gòu)建原核表達(dá)載體PBET-4-TLR3 ORF的質(zhì)粒連接正確,且廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列全長為2757bp,A+T含量為59.15%,C+G含量占40.85%,編碼918個(gè)氨基酸;(2)轉(zhuǎn)有PBET-4-TLR3 ORF的DE3表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘
6、導(dǎo)表達(dá)后,結(jié)果顯示廣西瑤山亞種樹鼩TLR3重組蛋白成功表達(dá),分子大小為125kDa左右,與預(yù)期目的蛋白理論值基本符合。廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白分析結(jié)果顯示:分子量為105.3041kDa,等電點(diǎn)為8.31;疏水性分值在-3.0至4.0之間;該蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu),且有19個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,其中胞內(nèi)段為TIR結(jié)構(gòu),胞外段和胞內(nèi)段分別有18個(gè)和1個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;還發(fā)現(xiàn)它具有37個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中含有3個(gè)蘇氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)絡(luò)氨酸蛋白激酶
7、磷酸化位點(diǎn)和27個(gè)絲氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。(3)對廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,如:基因序列比對顯示廣西瑤山亞種樹鼩與滇西亞種樹鼩的TLR3基因序列相似性最高,為98.33%,但仍有差異;與人、黑猩猩、獼猴、狗、豬的相似性次之,為84.75%、84.71%、84.50%、84.48%、84.84%,與嚙齒類動(dòng)物的相似性最低。通過氨基酸序列同源性比對,發(fā)現(xiàn)廣西瑤山亞種與滇西亞種樹鼩TLR3屬于同一個(gè)類群,與
8、獼猴、黑猩猩和人的距離近,證實(shí)廣西瑤山亞種樹鼩接近于靈長類動(dòng)物;
結(jié)論與意義:首次成功克隆廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列,并成功構(gòu)建原核表達(dá)載體PBET-4-TLR3 ORF,誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達(dá)出分子量大小約125kDa左右的特異性條帶蛋白。廣西瑤山亞種樹鼩和滇西亞種樹鼩TLR3蛋白有11個(gè)氨基酸不同,因此二者TLR3在抗原性方面可能有所不同。本研究為后續(xù)廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因的熒光定量
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