發(fā)展面向于活細(xì)胞研究的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù).pdf

1、細(xì)胞是組成生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，一切生命現(xiàn)象都是細(xì)胞活動(dòng)的體現(xiàn)。細(xì)胞的生命活動(dòng)是一個(gè)時(shí)刻發(fā)生變化、同時(shí)又具有顯著空間差異的過程，其增殖、新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)直接影響著人類的生長(zhǎng)和發(fā)育，一切疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制也必須以細(xì)胞病變研究為基礎(chǔ)。因此，細(xì)胞體系研究是現(xiàn)代生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。然而，由于細(xì)胞體系具有復(fù)雜性、動(dòng)態(tài)性和具有生命活性等特點(diǎn)，發(fā)展和利用無損、可靠性好、靈敏度高的分析技術(shù)對(duì)復(fù)雜細(xì)胞體系的生命活動(dòng)進(jìn)行研究具有

2、十分重要的學(xué)術(shù)意義及應(yīng)用價(jià)值。
　　表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)因其具有極高的檢測(cè)靈敏度、能從分子水平上獲取待測(cè)體系的本征信息，譜峰窄、適用于多組分檢測(cè)、無損且不受自發(fā)熒光和水的干擾等突出優(yōu)勢(shì)，特別適合于生物體系，尤其是活細(xì)胞體系的研究。目前，SERS作為一種新興光譜技術(shù)已經(jīng)在生物分子、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、組織甚至活體等生物體系的研究中都發(fā)揮了重要作用。SERS應(yīng)用于細(xì)胞體系研究的基本方法主要有直接檢測(cè)和間接檢測(cè)兩類。直接檢測(cè)法

3、充分發(fā)揮了SERS技術(shù)能獲得細(xì)胞體系本征信息的優(yōu)勢(shì)，但細(xì)胞體系的SERS光譜信息通常十分復(fù)雜，需要各種生物分子的標(biāo)準(zhǔn)SERS光譜作為參考對(duì)其進(jìn)行可靠歸屬和分析;然而，由于大部分生物分子的拉曼散射截面較小且與納米結(jié)構(gòu)的作用較弱，目前獲得生物分子的高靈敏、可靠SERS光譜仍然存在挑戰(zhàn)。由于細(xì)胞內(nèi)含有大量生物分子，因此利用SERS直接檢測(cè)方法可以獲得細(xì)胞自身組分的本征光譜信息。但對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的一些重要參數(shù)，如pH和溫度等，沒有能直接提供該參數(shù)特

4、征的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，因此需要借助外來探針作為指示，繼而利用SERS間接檢測(cè)方法對(duì)這些細(xì)胞的重要參數(shù)進(jìn)行傳感。間接檢測(cè)法利用有標(biāo)記分子修飾的SERS探針強(qiáng)信號(hào)和多功能的優(yōu)勢(shì)，特別適合于細(xì)胞體系微環(huán)境傳感、多組分檢測(cè)以及細(xì)胞成像研究。但SERS探針獲得的信息可能受到細(xì)胞復(fù)雜環(huán)境的影響，因此靈敏、可靠地對(duì)細(xì)胞體系進(jìn)行監(jiān)測(cè)是間接檢測(cè)的核心問題。此外，如何在開展研究的同時(shí)盡量保證細(xì)胞活性以及生命活動(dòng)的正常進(jìn)行也是細(xì)胞體系研究需要重視的問題。
　

5、　針對(duì)以上問題，本論文發(fā)展了基于SERS技術(shù)的可靠、靈敏的直接和間接檢測(cè)方法來開展細(xì)胞體系的相關(guān)研究，主要內(nèi)容和成果如下:
　　1.發(fā)展了適用于生物分子直接檢測(cè)的亞穩(wěn)態(tài)SERS檢測(cè)方法，通過對(duì)樣品制備和SERS檢測(cè)方式的改進(jìn)確保了用于生物分子檢測(cè)時(shí)的靈敏度和可靠性。利用基于金納米粒子的亞穩(wěn)態(tài)SERS檢測(cè)方法首次獲得了構(gòu)成生物體各種蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸分子的高靈敏、可重現(xiàn)的SERS光譜，并成功拓展至多肽以及蛋白的SERS直接檢測(cè)

6、。
　　2.采用小牛血清蛋白(BSA)作為保護(hù)分子對(duì)探針表面進(jìn)行修飾的方法制備了基于SERS技術(shù)的pH傳感納米探針并用于活細(xì)胞內(nèi)的可靠pH傳感。pH傳感探針主要由三部分組成:金納米粒子作為SERS增強(qiáng)基底，對(duì)巰基吡啶(4-MPy)作為pH傳感分子吸附在金納米粒子表面，最外層的BSA作為保護(hù)分子層起到了避免探針嚴(yán)重聚集、保護(hù)信號(hào)分子的穩(wěn)定性以及改善探針生物相容性的重要作用。通過系統(tǒng)的表征，該pH傳感納米探針表現(xiàn)出了優(yōu)越的pH響應(yīng)效果

7、以及應(yīng)用于細(xì)胞體系時(shí)的穩(wěn)定性、可靠性和生物相容性。將這種靈敏、可靠的pH傳感納米探針與活細(xì)胞共孵育后進(jìn)行SERS成像，獲得了單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)pH分布圖像。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)探針進(jìn)行了穿膜肽修飾用以提高探針的細(xì)胞內(nèi)化效率，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)pH分布的高效成像以及SERS-熒光雙模式成像。
　　3.通過對(duì)大面積、均一、具有高增強(qiáng)SERS效應(yīng)的金納米粒子組裝基底進(jìn)行pH傳感分子(4-MPy)的修飾，制備了基于SERS技術(shù)的pH傳感基底用于貼壁活

8、細(xì)胞外的可靠pH傳感。首先探究了4-MPy在金納米粒子組裝基底上的吸附行為和SERS光譜變化機(jī)制并系統(tǒng)地表征了pH傳感基底的pH響應(yīng)效果、靈敏度、穩(wěn)定性、循環(huán)性能、響應(yīng)速度和可靠性。隨后，對(duì)在pH傳感基底上的貼壁活細(xì)胞進(jìn)行SERS成像，獲得了單個(gè)活細(xì)胞外pH分布圖像。
　　4.為了盡量保證活細(xì)胞研究中細(xì)胞的活性，建立了細(xì)胞原位培養(yǎng)與顯微檢測(cè)平臺(tái)。通過顯微觀察，活細(xì)胞在原位培養(yǎng)狀態(tài)下的生命活動(dòng)狀態(tài)更為活躍，體現(xiàn)了原位培養(yǎng)對(duì)于開展活細(xì)