PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫的構(gòu)建及其感染常用小動物的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA病毒，對宿主的特異性要求非常嚴(yán)格，只能感染與其天然宿主種屬關(guān)系接近的動物。目前用于研究HBV感染的動物模型主要有黑猩猩、樹鼩、土拔鼠、鴨及各種小鼠模型，但由于來源困難、價格昂貴、感染效率低、結(jié)果穩(wěn)定性差、繁殖率低、兇猛難操作、模型制備困難，不能完全重復(fù)HBV的整個感染周期等各種原因，限制了它們的應(yīng)用。為了彌補(bǔ)上述缺陷，構(gòu)建新型乙型肝炎動物模型當(dāng)前研究HBV的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。
　　多年的研究證實(shí)，HB

2、V的PreS1區(qū)參與病毒感染早期的結(jié)合及進(jìn)入，決定了宿主的種族及組織特異性。其中有試驗(yàn)指出其主要活性部位最小可限制在aa5-20序列?；诖嗽?，本課題采用基因重組技術(shù)分別對HBVPreS1區(qū)的aa9-17、aa12-21、aa16-24序列進(jìn)行隨機(jī)化改造，構(gòu)建PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)的復(fù)制型HBV載體庫，并對其感染常用小動物進(jìn)行初步研究。本課題由兩部分構(gòu)成。
　　第一部分、PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫的構(gòu)建
　　目的

3、：對HBV PreS1區(qū)的aa9-17、aa12-21和aa16-24序列分別進(jìn)行隨機(jī)化改造，構(gòu)建PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫。
　　方法：
　　1.應(yīng)用基因重組技術(shù)，以pCH-3093為載體，依次構(gòu)建3種過渡質(zhì)粒pCH-3093-Alw(-)、pCH-3093-AlwN1、pCH-3093-Insert。
　　2.設(shè)計并合成PreS1區(qū)的3種隨機(jī)引物S1 rand9-17、S1 rand12-21、S1 ran

4、d16-24及一種3’端與隨機(jī)引物互補(bǔ)的引物S11038(-)。三種隨機(jī)引物分別與S11038(-)引物在Klenow Fragment作用下延伸為雙鏈，即可合成隨機(jī)片段。
　　3.通過一系列質(zhì)粒構(gòu)建，將隨機(jī)片段插入到野生型HBV相應(yīng)的PreS1區(qū)，即可構(gòu)成PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫。
　　4.檢測PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫的庫容、隨機(jī)性及復(fù)制能力。
　　結(jié)果：
　　1.本研究成功構(gòu)建了3種過渡質(zhì)

5、粒pCH-3093-Alw(-)、pCH-3093-AlwN1、pCH-3093-Insert，并進(jìn)行了大小及酶切位點(diǎn)鑒定。
　　2.合成了PreS1區(qū)的3種隨機(jī)引物S1 rand9-17、S1 rand12-21、S1 rand16-24及1種與隨機(jī)引物的3’端互補(bǔ)的引物S11038(-)。并成功合成了3種隨機(jī)片段，將3種隨機(jī)片段插入到野生型HBV PreS1的相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建了PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫。
　　3.

6、通過統(tǒng)計分析證實(shí)，三種隨機(jī)庫庫容約為107，氨基酸的實(shí)際分布與理論頻數(shù)無顯著性差異，并擴(kuò)增獲得大量高純度的隨即庫質(zhì)粒。SouthernBlotting檢測證實(shí)，三種隨機(jī)庫的復(fù)制能力接近，比野生型HBV弱。
　　結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了3種PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫pCH-S1-917、pCH-S1-1221、pCH-S1-1624，隨機(jī)庫具有較大的庫容及良好的隨機(jī)性。3種隨即庫的復(fù)制能力接近，但比野生型HBV弱?？紤]隨即庫種

7、的某些堿基影響了病毒的復(fù)制能力，但并不影響隨即庫的應(yīng)用。這3種隨機(jī)庫為探索相應(yīng)HBV動物模型提供了一種便利的試驗(yàn)工具。
　　第二部分、應(yīng)用PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫感染常用小動物
　　目的：利用PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫感染W(wǎng)istar大鼠、SD大鼠、BALB/C小鼠、和新西蘭小白兔，了解病毒庫的感染能力。
　　方法：
　　1.分別給Wistar大鼠、SD大鼠、BALB/C小鼠和新西蘭小白兔注射3

8、種PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)性HBV庫pCH-S1-917、pCH-S1-1221、pCH-S1-1624，并于1個月和2個月后分別化驗(yàn)血清HBV-DNA定量。
　　2.注射病毒后2個月時，處死動物并分別提取肝組織內(nèi)的HBV cccDNA。以所提取的HBV cccDNA為模板，擴(kuò)增HBV PreS1區(qū)的隨機(jī)序列，將隨機(jī)序列插入到野生型HBV的相應(yīng)部位，構(gòu)建二代PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫，并進(jìn)行測序。
　　3.應(yīng)用二代隨

9、機(jī)庫再次注射相應(yīng)動物，并于1個月和2個月時分別化驗(yàn)血清HBV-DNA定量。
　　4.2個月時取感染動物的肝組織行免疫組織化學(xué)檢查，了解HBsAg和HBcAg的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.注射病毒后動物的一般情況良好，較注射前無明顯變化，1個月時化驗(yàn)血清HBV-DNA定量。化驗(yàn)結(jié)果顯示所有注射隨機(jī)病毒的動物均陽性，W7的病毒滴度量最高，為2.43×105copies/mL；其余定量介于103-104copies/mL

10、之間。注射野生型的對照動物均陰性。
　　2.新西蘭小白兔和BALB/C的肝組織中可擴(kuò)增出相應(yīng)的HBV PreS1感染決定區(qū)的隨機(jī)片段，而Wistar大鼠、SD大鼠陰性對照動物擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，可能在注射病毒2個月后Wistar大鼠和SD大鼠大鼠體內(nèi)的病毒已清除。
　　3.將從兔子和BALB/C小鼠肝組織內(nèi)所擴(kuò)增出的隨機(jī)片段插入到野生型HBV的相應(yīng)序列內(nèi)，成功構(gòu)建了二代PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫pCH-S1-rabbi

11、t和pCH-S1-mouse。
　　4.對隨機(jī)庫pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse進(jìn)行測序，結(jié)果顯示前者21個菌落均來自隨機(jī)庫pCH-S1-1221；后者除1個來自pCH-S1-917，其余的15個來自隨機(jī)庫pCH-S1-1221。
　　5.二代隨機(jī)庫pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse分別感染兔子及BALB/C小鼠，于第1個月和第2個月時化驗(yàn)血清船HBV-DNA，結(jié)果顯示前后兩個月的病毒定

12、量無明顯變化，均為弱陽性。
　　6.第一和第二代病毒庫所感染動物的肝組織均有HBsAg和HBcAg的表達(dá)。以Wistar大鼠表達(dá)量最高，肝細(xì)胞內(nèi)外均可檢測到。
　　結(jié)論：應(yīng)用PreS1感染決定區(qū)隨機(jī)化HBV庫成功感染了Wistar大鼠、Sprague Dawley大鼠、新西蘭小白兔和BALB/C小鼠。并可在血清內(nèi)檢測出HBV-DNA，于肝組織內(nèi)檢測出HBsAg和HBcAg兩種抗原的表達(dá)。于肝組織內(nèi)擴(kuò)增出感染的HBV基因組并測