菌酶協(xié)同處理棉籽粕的營養(yǎng)特性、棉籽肽的制備及其抗氧化活性研究.pdf

1、棉籽粕是世界范圍內(nèi)重要的植物蛋白原料，由于其含有棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，蛋白消化利用率低等原因，限制了其在飼料中的大規(guī)模應(yīng)用。近年來，已開發(fā)出以固態(tài)發(fā)酵為主的棉籽粕脫毒工藝，但對提高其蛋白品質(zhì)，特別是涉及發(fā)酵后所產(chǎn)生的低分子量肽類的功能活性研究相對較少。鑒于此，本研究首先從實驗室保藏的菌株中篩選出適合棉籽粕固態(tài)發(fā)酵的芽孢桿菌菌株，在此基礎(chǔ)上，嘗試篩選功能蛋白酶作為發(fā)酵佐劑進一步提高微生物發(fā)酵棉籽粕的效果;隨后從棉籽粕中制備了棉籽肽組分并初步分

2、析了其體外抗氧化活性和經(jīng)過體外模擬消化后的穩(wěn)定性;并進一步分離、純化和鑒定了棉籽肽混合物中的單一抗氧化肽序列;最后通過雙氧水誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞(RAW264.7)模型和Sprague-Dawley(SD)大鼠飼養(yǎng)試驗，分別探討了抗氧化棉籽肽對氧化損傷細胞的保護作用機制及其在動物體內(nèi)的抗氧化效果。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.菌酶協(xié)同處理提高棉籽粕的營養(yǎng)品質(zhì)
　　 本試驗以游離棉酚降解率和蛋白水解度為指標(biāo)，對實驗室保藏的7

3、株芽孢桿菌進行篩選，并對接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度等發(fā)酵條件進行了響應(yīng)面優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，從酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶等5種蛋白酶中篩選合適的蛋白酶作為發(fā)酵佐劑用于棉籽粕發(fā)酵;并對菌酶協(xié)同處理后，棉籽粕的飼料常規(guī)營養(yǎng)成分、蛋白降解情況、體外消化率和抗氧化活性等進行分析。結(jié)果表明:(1)7株候選菌株中，枯草芽孢桿菌BJ-1可降低(p＜0.05)棉籽粕中的游離棉酚含量，同時提高(p＜0.05)其蛋白水解度，為

4、合適的發(fā)酵菌株;(2)優(yōu)化后芽孢桿菌BJ-1發(fā)酵棉籽粕的最佳條件為:接種量2％、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度37℃，在此條件下，棉籽粕的脫毒率可達66.74％;(3)添加0.1％(w/v)，即10000 U/kg木瓜蛋白酶可進一步提高(p＜0.05)蛋白水解度，但對游離棉酚含量的影響不顯著(p＞0.05);(4)在采用木瓜蛋白酶和芽孢桿菌BJ-1協(xié)同處理棉籽粕后，與處理前相比，可提高(p＜0.05)其粗蛋白質(zhì)和氨基酸含量，同時降低(p＜0

5、.05)粗纖維、粗脂肪和游離棉酚含量;(5)菌酶協(xié)同處理棉籽粕還有效降解了棉籽蛋白的9S和5S組分，提高了(p＜0.05)棉籽蛋白的體外消化率和對1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)的清除活性。結(jié)果提示，采用芽孢桿菌BJ-1發(fā)酵結(jié)合木瓜蛋白酶處理的方式可有效改善棉籽粕的營養(yǎng)品質(zhì)。
　　 2.棉籽肽的制備及其抗氧化特性研究
　　 為了進一步分析菌酶處理對棉籽粕抗氧化活性的影響，試驗從棉籽粕處理樣品中提取了小于3 kDa

6、的低分子量肽類組分，確定了其化學(xué)組成和分子量分布，并以DPPH清除率、羥自由基清除率、金屬離子螯合力和總還原力等為指標(biāo)，對所提取棉籽肽的體外抗氧化活性進行了探討。同時，采用胃蛋白酶和胰酶相結(jié)合的兩步體外消化手段，分析了棉籽肽在模擬腸胃液消化后的蛋白降解情況、分子量分布改變和抗氧化功能。結(jié)果表明:(1)棉籽肽的體外抗氧化活性與其使用量和菌酶協(xié)同處理棉籽粕的時間均有關(guān)。在菌酶處理48 h后，所提取棉籽肽的DPPH自由基、羥自由基清除活性，金

7、屬離子螯合能力和總還原力的半數(shù)效應(yīng)濃度均達到最低值，分別為2.15、2.93、2.06和2.18 mg/mL;(2)棉籽肽的氨基酸組成和分子量分布測定表明，其含有較多的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸，且疏水性氨基酸總量達到28.31％;同時分子量小于1 kDa的組分占棉籽肽混合物的56.52％;(3)在采用胃蛋白酶和胰酶體外消化棉籽肽4h后，其蛋白水解度顯著提高(p＜0.05)，肽段分子量進一步降低;(4)抗氧化活性分析表明，與消化前相比，棉

8、籽肽的DPPH自由基清除率降低了40.3％(p＜0.05)，羥自由基提高了36.64％(p＜0.05)，金屬離子螯合活力提高了17.62％(p＜0.05)，總還原力降低了7.69％(p＜0.05)。結(jié)果提示，菌酶處理棉籽粕中提取的棉籽肽具有較高的體外抗氧化活性，為一種天然的抗氧化劑，且經(jīng)過體外模擬消化后仍具有抗氧化功能。
　　 3.抗氧化棉籽肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
　　 為了分析棉籽混合肽中的活性肽序列，通過將凝膠過濾色

9、譜和制備型高效液相色譜相結(jié)合的方式對棉籽肽混合物中具有最高抗氧化活性的肽段進行分離純化，并運用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對分離純化得到的棉籽抗氧化肽的氨基酸序列進行解析。結(jié)果表明:(1)利用葡聚糖G-15凝膠色譜可將棉籽肽分成4個組分(A～D);通過體外抗氧化活性分析發(fā)現(xiàn)，組分A具有最高的抗氧化活性;(2)制備型高效液相色譜可進一步將組分A分為9個主要組分(A-1～A-9)，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，篩選獲得最強抗氧化肽組

10、分A-8和A-9，并經(jīng)分析型液相色譜鑒定為單一峰;(3)采用飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析后，鑒定抗氧化肽A-8的相對分子量為823.37 Da，氨基酸序列為STFAPSGSA;抗氧化肽A-9的相對分子質(zhì)量為1752.78 Da，氨基酸序列為GAAANDRDNPVRDDGPGG。
　　 4.棉籽肽對小鼠巨噬細胞RAW264.7和SD大鼠抗氧化功能的影響
　　 為了進一步探討棉籽肽及其純化組分A-8對氧化損傷細胞的保護作用及其可能機

11、制，通過向小鼠巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)液中加入終濃度為600μM的雙氧水誘導(dǎo)其產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并研究了棉籽肽及其純化肽組分A-8(STFAPSGSA)對氧化損傷RAW264.7細胞活性、細胞基因組DNA、胞內(nèi)抗氧化酶活、抗氧化代謝產(chǎn)物和細胞凋亡相關(guān)的p53基因表達的影響。另一方面，為了研究棉籽肽在動物機體內(nèi)的抗氧化功能，將18只雄性SD大鼠（108.47±5.42 g）隨機分成3組，其中對照組大鼠飼喂基礎(chǔ)日糧并灌喂生理鹽水(1 mL/

12、d);高脂組和棉籽肽處理組大鼠飼喂高脂日糧并分別灌喂1 mL/d的生理鹽水或濃度為2％的棉籽肽。試驗結(jié)束后(14d)，分別測定SD大鼠的增重情況、器官指數(shù)和血清及肝臟中的抗氧化酶活。結(jié)果表明:(1)棉籽肽對細胞基因組DNA的體外氧化損傷具有保護作用;(2)采用濃度為0.5和2.0 mg/mL的棉籽肽或50μg/mL的純化肽組分A-8預(yù)培養(yǎng)細胞12 h，可降低(p＜0.05)雙氧水對RAW264.7細胞活性的抑制作用;(3)與氧化應(yīng)激組相

13、比，添加2.0 mg/mL的棉籽混合肽和50μg/mL的純化肽組分A-8提高了(p＜0.05)細胞內(nèi)的過氧化氫酶活性;棉籽混合肽及其組分A-8均可提高(p＜0.05)細胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性;濃度為0.5和2.0 mg/mL的棉籽肽和50μg/mL肽組分A-8預(yù)處理細胞可提高(p＜0.05)細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性;(4)添加0.5 mg/mL棉籽肽和50μg/mL的組分A-8均可降低(p＜0.05)細胞內(nèi)的丙二醛(