folP1與folP2基因在磺胺甲惡唑-甲氧芐啶抗分枝桿菌中的作用機制研究.pdf

1、結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobactrium tuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染病。耐藥TB的出現(xiàn)使得TB成為嚴重的公共衛(wèi)生問題和社會問題，現(xiàn)有的抗TB藥物已經(jīng)不能滿足需要，新藥的研發(fā)顯得更為迫切。然而新藥的研發(fā)又需要耗費大量的時間與金錢，如果能利用已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物來治療TB，將使得TB藥物的研發(fā)更加快速、便宜。磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole，SMX)在體內(nèi)和體外均具

2、有抗TB作用，是治療耐藥TB的候選藥物之一。在臨床上SMX與甲氧芐啶(trimethoprim，TMP)聯(lián)合用于治療細菌引起的呼吸道、泌尿道和胃腸道感染。研究發(fā)現(xiàn)SMX與TMP主要作用機制分別是靶向葉酸合成途徑中的二氫蝶酸合酶(dihydropteroic acid synthase，DHPS)和二氫葉酸還原酶(dihydrofolic acid，DHFR);但是SMX與TMP在分枝桿菌中的作用機制至今還未被闡明。
　　本研究旨在

3、探究分枝桿菌中folP1與folP2基因在TMP-SMX抗分枝桿菌中的作用，從而加速以TMP-SMX為基礎(chǔ)的抗TB新藥的研發(fā)。在分枝桿菌中，folP1基因編碼DHPS，而folP2基因編碼的蛋白與其具有同源性。本研究通過在恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，Msm）中分別過表達Mtb和Msm的folP1/2基因及敲除Msm folP2基因，得到重組菌株Msm∷p60fp1，Msm∷p60fp2，Msm∷p60M

4、sfp1，Msm∷p60Msfp2和Msm△folP2，再通過固體平板法檢測SMX和TMP對這些重組菌株的的最小抑制濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Msm中過表達MtbfolP1基因會使SMX和TMP的MIC都增加4倍;在Msm中過表達Msm folP1基因會使SMX和TMP的MIC都增加2倍。另外，敲除Msm的folP2基因后，SMX對其的MIC降低至野生型Msm的1/8，這

5、可能是由于folP2基因產(chǎn)物的存在減弱了SMX的抑菌效果，暗示了FolP2抑制劑與SMX聯(lián)用時可能會有較好的抗TB效果。
　　在本研究中我們也在嘗試改進分枝桿菌基因敲除技術(shù)。由于Mtb生長緩慢，需要在P3實驗室操作等原因，許多已存在的高效率的基因敲除技術(shù)都不能應(yīng)用于Mtb。在過去20年，雖然出現(xiàn)了大量的分枝桿菌基因敲除技術(shù)，但這些技術(shù)，要么需要通過電轉(zhuǎn)化將DNA轉(zhuǎn)入分枝桿菌體內(nèi)，要么需要利用噬菌體作為載體將同源的DNA遞送到Mtb

6、菌內(nèi)，然后通過同源重組達到基因敲除的目的。分枝桿菌電轉(zhuǎn)化效率低，再加上同源重組的低效率極大地限制了相關(guān)技術(shù)在分枝桿菌中的應(yīng)用，尤其是慢速分枝桿菌。即便是最近引入了重組工程的方法來增強重組效率，利用電轉(zhuǎn)化獲得基因敲除株的效率仍然很低;然而構(gòu)建噬菌體的方法，需要體外包裝的步驟，不僅制備昂貴而且受到DNA包裝大小的更嚴格的限制。本研究通過改進的方法將等位交換底物（allelic exchange substrates，AESs）插入分枝桿菌p