RanGTPase激活蛋白RanGAP在嗜熱四膜蟲細胞中的定位及功能分析.pdf

1、RanGTPase激活蛋白（RanGTPase-activating protein，RanGAP）是細胞質(zhì)中調(diào)節(jié)Ran活性的重要因子，含有保守的富含亮氨酸的LRR（leucine-rich repeats）結(jié)構(gòu)域。RanGAP可與Ran蛋白結(jié)合并促進Ran對GTP的水解。哺乳動物RanGAP1蛋白通過Ran通路參與了多種生命活動，包括核質(zhì)運輸、有絲分裂中期紡錘體的組裝、分裂后期核膜的重建；RanGAP1調(diào)節(jié)擬南芥雌性配子的發(fā)育過程中減

2、數(shù)分裂后的第二次有絲分裂的進行；酵母RanGAP1蛋白參與了異染色體的組裝。
　　真核單細胞原生動物嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）同時含有小核及大核兩個細胞核，具有有性生殖及無性生殖兩種生殖方式。對Ran蛋白通路在嗜熱四膜蟲中功能的研究表明Ran1、RBP1及RCC1的異常表達會導(dǎo)致大核無絲分裂的異常。目前，尚未有RanGAP在雙核纖毛蟲細胞中的功能報道。本研究首次從嗜熱四膜蟲大核基因組中鑒定出一個保

3、守的RanGAP基因，并對RanGAP蛋白序列、定位模式及生物功能進行了分析，主要結(jié)果如下：
　　1. RanGAP基因的生物信息學(xué)分析 RanGAP（TTHERM_00766430）全長1423bp，包含兩個內(nèi)含子，開放閱讀框為1074 bp，預(yù)測編碼357個氨基酸，含有一個富含亮氨酸的LRRs結(jié)構(gòu)域。實時熒光定量PCR表明，RanGAP在四膜蟲生長期、饑餓期和有性生殖期均有表達，且在有性生殖4~6 h表達水平最高。不同物種中的

4、RanGAP蛋白序列比對分析結(jié)果表明RanGAP蛋白進化上具有保守的結(jié)構(gòu)域和物種特異的可變區(qū)。
　　2. HA-RanGAP在細胞內(nèi)的定位構(gòu)建含有HA-tag的pNeo4-HA-GAP載體并轉(zhuǎn)化入嗜熱四膜蟲細胞中，利用巴龍霉素抗性篩選出HA-GAP突變嗜熱四膜蟲株。免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)：HA-RanGAP在嗜熱四膜蟲的生長期、饑餓期及有性生殖早期均定位于四膜蟲的胞質(zhì)中，并在大核周圍富集；當(dāng)有性生殖進行到“anlagen”時期及配對細胞

5、分開后，HA-RanGAP不僅定位于胞質(zhì)中，而且在凋亡的親本大核上富集。當(dāng)配對細胞分開后，親本大核內(nèi)的DNA進一步凝縮，HA-RanGAP在親本大核中表現(xiàn)出不均一的定位，而且HA-RanGAP的定位與凝縮的DNA交錯，表明HA-RanGAP定位于核質(zhì)中。HA-RanGAP的Western印跡分析顯示40 kD和48 kD的兩條特異條帶。40 kD應(yīng)為 HA-RanGAP，48 kD可能是 SUMO化修飾后的 HA-RanGAP（HA-R

6、anGAP-X）。隨著有性生殖進程的進行，HA-RanGAP-X的相對表達量增加暗示SUMO化修飾的RanGAP可能參與了新本大核的凋亡過程。
　　3. RanGAP異常表達會導(dǎo)致細胞核分裂及胞質(zhì)縊縮異常構(gòu)建過表達載體pXS-RanGAP及敲除載體pNeo4-KO-RanGAP并轉(zhuǎn)化入四膜蟲細胞，篩選得到過表達及敲除RanGAP四膜蟲突變株。結(jié)果表明RanGAP的過表達導(dǎo)致嗜熱四膜蟲無性生殖時大核不能正常拉伸且胞質(zhì)縊縮異常，最終生

7、成無大核細胞。RanGAP基因敲減會引起大核呈現(xiàn)彌散狀或不規(guī)則形狀，大核的無絲分裂受到抑制從而生成無大核后代。
　　4. RanGAP的異常表達影響RAN、RBP1、RCC1的轉(zhuǎn)錄水平實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，過表達或敲除RanGAP基因后，通路中的RAN1、RBP1及RCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下調(diào)或者上調(diào)，表明四膜蟲Ran信號通路中各因子在功能上存在相互調(diào)節(jié)。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲中鑒定出一個RanG