抗沉默因子Asf1調(diào)控嗜熱四膜蟲細(xì)胞核的穩(wěn)定性.pdf

1、組蛋白分子伴侶能協(xié)助組蛋白參與染色質(zhì)的組裝和解凝，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，對(duì)核小體的組裝解凝起到了重要作用。不同組蛋白分子伴侶對(duì)核小體裝配解凝有不同的作用，進(jìn)而影響核小體的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)以及染色體狀態(tài)，從而影響生物的發(fā)育過程。高等真核生物細(xì)胞中組蛋白異二聚體H3/H4的分子伴侶Asf1(anti-silencing function1，Asf1)參與依賴DNA復(fù)制及不依賴DNA復(fù)制的核小體裝配，同時(shí)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，基因沉默以及DNA損傷修復(fù)等過

2、程，在不同生物中Asf1具有一定的功能保守性，同時(shí)進(jìn)化出新的功能。
　　嗜熱四膜蟲是一種重要的真核模式生物，細(xì)胞包含一個(gè)二倍體的生殖小核和一個(gè)多倍體的體細(xì)胞大核。在營養(yǎng)生長時(shí)期，嗜熱四膜蟲細(xì)胞小核進(jìn)行有絲分裂，而大核進(jìn)行無絲分裂；在有性生長時(shí)期，細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)，小核通過減數(shù)分裂和有絲分裂產(chǎn)生配子核，新大核通過合子核基因重排形成，親本大核凋亡。四膜蟲核的二態(tài)性及多樣化的核發(fā)育形態(tài)成為研究組蛋白及其分子伴侶重要的模式體系。本研究對(duì)組蛋白

3、分子伴侶Asf1在四膜蟲細(xì)胞中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析，獲得主要結(jié)果如下：
　　1.嗜熱四膜蟲中ASF1基因生物信息學(xué)分析嗜熱四膜蟲ASF1（TTHERM_00442300）基因全長756 bp，無內(nèi)含子，預(yù)測(cè)編碼的 N端1～155位是保守的Asf1功能結(jié)構(gòu)域，酸性 C端區(qū)域參與調(diào)節(jié)功能，N端結(jié)構(gòu)域序列同源進(jìn)化樹分析表明， Asf1的分子進(jìn)化與物種進(jìn)化基本一致。RT-PCR結(jié)果表明，ASF1在嗜熱四膜蟲的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，并且在有性生

4、殖4~6h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高。
　　2. HA-Asf1定位在大核和小核我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒pNeo-HA-ASF1，并將其轉(zhuǎn)化四膜蟲細(xì)胞，巴龍霉素抗性條件下篩選得到穩(wěn)定表達(dá)HA-Asf1的細(xì)胞株。通過免疫熒光定位分析表明，HA-Asf1在營養(yǎng)生長時(shí)期，饑餓時(shí)期以及有性生長時(shí)期定位于大核、小核以及新形成的大小核中，發(fā)育前期大核的信號(hào)更強(qiáng)，而到了Anlagen時(shí)期小核信號(hào)增強(qiáng)，而在即將凋亡的親本大核中，定位信號(hào)逐漸減弱最后消失。

5、　　3.過表達(dá)ASF1后核變大并影響細(xì)胞的增殖構(gòu)建過表達(dá)pXS-ASF1重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲細(xì)胞，通過巴龍霉素篩選，PCR鑒定，ASF1通過同源重組替代MTT1基因，使ASF1在Cd2+誘導(dǎo)下受MTT1啟動(dòng)子調(diào)控而過量表達(dá)Asf1。過表達(dá)ASF1后，免疫熒光定位分析HA-Asf1在四膜蟲營養(yǎng)生長期、饑餓期和有性生長期定位于大核、小核以及新形成的大小核中。定位模式與在自身啟動(dòng)子調(diào)控下Asf1的定位模式基本一致。過表達(dá)ASF1細(xì)胞

6、株的大核小核均出現(xiàn)核型變大，并抑制細(xì)胞增殖。
　　4.敲減ASF1后導(dǎo)致大核形態(tài)異常及小核缺失構(gòu)建敲除質(zhì)粒pNeo-ASF1并轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲細(xì)胞，通過巴龍霉素篩選，PCR鑒定，Neo4部分替代ASF1基因。敲減ASF1的細(xì)胞株篩選過程出現(xiàn)無小核細(xì)胞株，細(xì)胞生長抑制，不能進(jìn)行正常的有性生殖過程和產(chǎn)生有性生殖后代。大核形態(tài)異常，部分細(xì)胞觀察到有大核逐出體的存在。
　　嗜熱四膜蟲Asf1是進(jìn)化上保守的功能蛋白，含有保守的功能結(jié)構(gòu)