適于四膜蟲(chóng)的嗜水氣單胞菌外膜蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及蟲(chóng)菌共培養(yǎng)的體外試驗(yàn).pdf

1、嗜水氣單胞（Aeromonas hydrophila）是人和多種動(dòng)物的病原菌，其外膜蛋白（outermembrane protein，OMP）具有良好的免疫原性。嗜熱四膜蟲(chóng)（Tetrahymena thermophila）是一種營(yíng)自生的非致病性纖毛蟲(chóng)，許多研究表明其可作為一個(gè)理想的異種表達(dá)載體。
　　 按照真核細(xì)胞四膜蟲(chóng)的基因密碼子偏好，優(yōu)化外膜蛋白 A（OmpA）基因密碼子，并化學(xué)合成一段抗原性較強(qiáng)的基因片斷，將其克隆至pUC

2、18-T載體，經(jīng)測(cè)序確定合成正確。設(shè)計(jì)一對(duì)引物在兩端分別加上EcoR I、XhoI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增ompA基因，定向克隆至表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）中，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定后測(cè)序。結(jié)果表明插入片段長(zhǎng)度為219 bp，與合成的序列相比，同源性為99％。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ompA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)分子量約30 KD的重組蛋白，用兔抗J-1株總外膜蛋白的血清進(jìn)行Western blot，在30 KD處有明顯反

3、應(yīng)條帶，說(shuō)明所表達(dá)的優(yōu)化OmpA保持原有外膜蛋白的反應(yīng)原性。
　　 根據(jù) neo基因的序列和化學(xué)合成的ompd基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，調(diào)整引物中起始密碼子ATG和終止密碼子TGA附近的結(jié)構(gòu)，分別獲取neo基因和ompd部分基因片斷，再通過(guò)重疊延伸的方法，將兩個(gè)基因通過(guò)一疏水性柔性多肽接頭（Gly4Ser）3堿基序列進(jìn)行前后拼接，構(gòu)建新的neo-linker-ompA融合基因。利用嗜熱四膜蟲(chóng)金屬硫蛋白MTT基因作為啟動(dòng)子，構(gòu)建了一個(gè)

4、適于嗜熱四膜蟲(chóng)的基因打靶載體。該載體利用MTT基因的5’側(cè)翼區(qū)作為同源臂，中間嵌入neo-linker-ompA融合基因編碼區(qū)，從而形成了一個(gè)表達(dá)盒。序列分析表明neo、ompA及接頭拼接組合的順序、方向及序列完全正確。質(zhì)粒的正確構(gòu)建為下一步在四膜蟲(chóng)中表達(dá)奠定基礎(chǔ)，該載體既滿足在四膜蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)外源蛋白的需要，又具有靶向性，因此具有很強(qiáng)的操作性。
　　 在分別繪制嗜水氣單胞菌J-1株和嗜熱四膜蟲(chóng)BF-1株生長(zhǎng)曲線的基礎(chǔ)上，選擇合適

5、的感染比，探討二者之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，嗜水氣單胞菌在4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，16-17 h達(dá)到最高；嗜熱四膜蟲(chóng)的生長(zhǎng)曲線表明，其適宜接種的初始密度為5×103細(xì)胞/mL，對(duì)數(shù)期10-44 h，穩(wěn)定期44-50 h；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的細(xì)菌和四膜蟲(chóng)按照10:1，50:1，100:1的感染比混合，發(fā)現(xiàn)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌全部被蟲(chóng)體緩慢消化，穩(wěn)定期的嗜水氣單胞菌以100:1感染比感染蟲(chóng)體時(shí)，可在蟲(chóng)體內(nèi)增殖