L-精氨酸激活離休永生化肝細(xì)胞LO2內(nèi)源凝血八因子外源表達(dá)機(jī)制及信號(hào)通路的研究.pdf

1、目的：利用L-精氨酸加入人離體肝細(xì)胞L02培養(yǎng)基中，使得L02中內(nèi)源凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ)重新表達(dá)，進(jìn)而研究L-精氨酸激活L02中內(nèi)源FⅧ重表達(dá)的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路。
　　方法：將L02分為加藥組，對(duì)照組，抑制劑組和空白抑制劑組，加藥組加入L-精氨酸（終濃度為15mM），對(duì)照組用同體積的滅菌水取代L-精氨酸培養(yǎng)，抑制劑組在加入L-精氨酸前3小時(shí)加入L-NAME（終濃度為100mM），空白抑制劑組

2、則只加入終濃度為100mM的L-NAME，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h和60h。用RT-PCR方法檢測(cè)L02中人FⅧ基因、iNOS基因、HNF1A基因、HNF4A基因、C/EBP alpha基因、NF-kappaB基因、I-kappaB alpha基因、CREB基因和sGC alpha3基因的轉(zhuǎn)錄水平，Western blot檢測(cè)L02中人FⅧ、常規(guī)I-kappaB和磷酸化I-kappaB的表達(dá)情況，PKA磷酸化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

3、實(shí)驗(yàn)體系中PKA磷酸化變化水平，雙蟲熒光素酶(dual luciferase)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FⅧ啟動(dòng)子上游調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄活性，MSP(methylation special pcr)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FⅧ啟動(dòng)子上游調(diào)控序列的甲基化水平。
　　結(jié)果：RT-PCR顯示，加藥組L02中人FⅧmRNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)照組、抑制劑組和空白抑制劑組均無人FⅧmRNA的轉(zhuǎn)錄，加藥組iNOS、HNF4A、NF-kappaB、I-kappaB alpha和CREB的轉(zhuǎn)錄

4、水平均有上升，HNF1A、sGC alpha3和C/EBP alpha轉(zhuǎn)錄水平均下降，對(duì)照組、抑制劑組和空白抑制劑組這些基因轉(zhuǎn)錄水平均無明顯變化;Western blot顯示加入L-精氨酸后，磷酸化I-kappaB表達(dá)量明顯增加，其他組別則無此變化; PKA檢測(cè)試劑盒顯示加藥組PKA磷酸化水平明顯增加，其他組別無明顯變化;雙蟲熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示加藥組人FⅧ啟動(dòng)子上游調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加;MSP實(shí)驗(yàn)顯示FⅧ啟動(dòng)子上游調(diào)控序列的甲基化水