工作環(huán)境中常見氣傳真菌快速檢測鑒別的DNA分子標記.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文工作環(huán)境中常見氣傳真菌快速檢測鑒別的DNA分子標記姓名：吳志紅申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：曲音波王曉茹20030228山東大學(xué)博士學(xué)位論文2非放射性探針標記雜交技術(shù)。在本實驗室建立了一套非放射性探針標記雜交方法，為PCR擴增與探針雜交方法相結(jié)合，進一步適應(yīng)檢測實際樣品中混合狀態(tài)的真菌，提高檢測的靈敏度奠定技術(shù)基礎(chǔ)。從文獻中摘取了9個寡核苷酸探針，以常見氣傳真菌的25個種作為被試菌種，通過非放射性探針標記

2、雜交技術(shù)檢測探針的特異性，并在該雜交系統(tǒng)中優(yōu)化了每一個探針達到特異檢測的雜交溫度。結(jié)果表明，已有探針在新建立的雜交檢測系統(tǒng)和廣泛的被檢真菌范圍上試驗時，其特異性和特異檢測條件會發(fā)生改變，有必要重新試驗。3環(huán)境樣品中真菌類群的檢測。利用血球計數(shù)板顯微鏡下測定真菌孢子總數(shù)、MEA和DGl8平板培養(yǎng)菌落計數(shù)(CFUs)、PCR特異擴增和PCR產(chǎn)物探針雜交檢測4種方法，對3個不同工作環(huán)境樣品中的常見氣傳真菌類群進行了檢測，并將不同檢測方法的結(jié)果

3、進行了分析比較。培養(yǎng)結(jié)果表明，盡管不同樣品中真菌孢予含量差異明顯，但是數(shù)量優(yōu)勢真菌或者是Penicilliumspp或者是Aspergillusspp，培養(yǎng)得到的其它常見氣傳真菌還有Cladosporiumspp、Paecilomycesspp、Rhizopusspp、Chrysoniliaspp、Trichodermaspp和Wallemiasebi。孢子總數(shù)計數(shù)結(jié)果是平板菌落計數(shù)結(jié)果的38倍。實驗證明環(huán)境空氣樣品中存在著PCR反應(yīng)抑

4、制因子，在DNA提取過程中抑制因子可進入DNA樣品中，通過稀釋DNA的方式可消除PCR抑制效應(yīng)。利用特異PCR引物和探針，我們可以確定在空氣樣品中存在著某類和某種真菌，其中的一些在培養(yǎng)法中未曾檢出。PCR擴增方法的檢測靈敏度為每個PCR反應(yīng)973孢子、13193CFUs。探針雜交檢測方法的檢測靈敏度為每個PCR反應(yīng)24孢子、0212CFUs。雜交檢測方法比PCR擴增方法更靈敏、更穩(wěn)定，樣品間的差異更小。實驗證明，PCR和探針雜交技術(shù)可以

5、特異、靈敏、準確地檢測鑒別樣品中的氣傳真菌，是常規(guī)孢子總數(shù)和菌落數(shù)檢測方法的良好補充，尤其是PCR為基礎(chǔ)的探針雜交技術(shù)在檢測環(huán)境樣品、進行環(huán)境監(jiān)測方面更具有應(yīng)用潛力，但是達到特異而系統(tǒng)地檢測環(huán)境樣品中存在的各個類群，需要建立和發(fā)展更多的特異PCR引物或者特異的雜交探針。418SrRNA系列檢測探針的建立。我們對常見氣傳真菌15個屬31個種49個真菌菌株的18SrRNA進行了序列測定。序列分析表明接合菌類(Zygomycota)與子囊菌類