蘇云金芽胞桿菌分離鑒定及對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)特異活性菌株研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)是世界上研究最多應(yīng)用范圍最廣的殺蟲(chóng)微生物,殺蟲(chóng)活性物質(zhì)包括Cry和Cyt兩大類(lèi)蛋白,在害蟲(chóng)生物防治中發(fā)揮了重要作用,但是也暴露了一些弊端,如殺蟲(chóng)譜窄、昆蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性等問(wèn)題,所以進(jìn)一步分離特異活性或者高活性的野生菌株,鑒定其基因型,為害蟲(chóng)防治提供更多的基因資源。
　　 本論文針對(duì)含有cry7類(lèi)基因的蘇云金芽胞桿菌野生菌株進(jìn)行了鑒定和評(píng)價(jià),從中篩選出了對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)特異活性的新菌株,針對(duì)這一新菌株生物學(xué)特

2、性、蛋白型、基因型以及作用機(jī)理等方面進(jìn)行了一系列的研究,主要內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　 1.利用醋酸鈉篩選法并經(jīng)基因型分析,從河北省土壤中分離篩選出了56株含有cry7基因的Bt菌株。在這些菌株中,10株菌同時(shí)含有cry7基因和其他cry基因,46株菌只含有單一cry7基因。大部分Bt菌株表達(dá)130kDa蛋白,僅有BQZ-12菌株產(chǎn)生80kDa和70kDa蛋白,BQZ-8菌株產(chǎn)生130kDa和80kDa蛋白。通過(guò)生物活性測(cè)定得到一株

3、對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性野生菌Bt WZ-9。
　　 2.WZ-9菌株在胞晶分離期產(chǎn)生菱形伴胞晶體,蛋白分子量為130kDa,對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的LC50值為0.209 mg/ML?；蛐丸b定結(jié)果表明該菌只含有單一的cry7基因,序列分析顯示該基因與cry7Ab1同源性達(dá)到99％,被Bt命名委員會(huì)命名為cry7Ab3(登錄號(hào)ABX24522)。
　　 3.為了明確Cry7Ab3蛋白的殺蟲(chóng)活性,從

4、Bt WZ-9菌株中克隆了cry7Ab3基因,該基因在大腸桿菌:BL21和Bt無(wú)晶體突變株HD73 cry中都能正確表達(dá)130kDa蛋白,其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)都具有較高毒力,LC50值分別為0.460mg/Ml和0.205mg/Ml,cry7Ab3基因在轉(zhuǎn)Bt無(wú)晶體突變株HD73-Cry7Ab3中形成的晶體(0.86μmx1.23μm)比野生菌產(chǎn)生的晶體(0.73μm×1.00μm)略大一些。這些結(jié)果證實(shí)了cry7Ab

5、3基因編碼蛋白發(fā)揮殺蟲(chóng)作用。
　　 4.為明確Cry7Ab3蛋白最短活性區(qū)序列,利用特異性引物分別克隆表達(dá)不同長(zhǎng)度的cry7Ab3基因片段,E coli Cry7Ab3-1(Metl-Phe657)、E coli Cry7Ab3-2(Metl-Phe626)、E coli Cry7Ab3-3(Asn30-Phe657)和E coli Cry7Ab3-4(Lys87-Phe657),并測(cè)定了表達(dá)產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒

6、力。結(jié)果表明E coli Cry7Ab3-1表達(dá)的75kDa蛋白毒力最高,LC50值為0.114mg/ML,可以確定Metl-Phe657為Cry7Ab3蛋白的最短活性區(qū)。
　　 5.分別利用胰蛋白酶和馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)中腸蛋白酶液體外酶解130kDa的Cry7Ab3原毒素(質(zhì)量比為100:1),均得到75kDa的酶解產(chǎn)物。與相同濃度的原毒素相比,75kDa的酶解產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)具有較高殺蟲(chóng)毒力。對(duì)馬鈴薯二十八星

7、瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸組織病理學(xué)研究表明,3齡幼蟲(chóng)取食Cry7Ab3原毒素蛋白3d后,中腸細(xì)胞嚴(yán)重破壞,細(xì)胞間出現(xiàn)明顯孔洞,幼蟲(chóng)表現(xiàn)出活動(dòng)緩慢,取食量下降的現(xiàn)象。取食5d后,中腸組織完全被破壞,幼蟲(chóng)開(kāi)始死亡。通過(guò)Ligand blotting技術(shù),檢測(cè)到馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)中腸BBMV上存在分子量為220kDa的Cry7Ab3毒素結(jié)合受體,經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定該受體蛋白為鈣粘蛋白。
　　 本論文創(chuàng)新之處在于發(fā)現(xiàn)了對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)特異活性的