源于地衣的蘇云金芽胞桿菌分離及對廣州管圓線蟲生測和活性因子的研究.pdf

1、本研究以非維管植物地衣為分離材料，采用抗生素加醋酸鈉熱處理的方法，從48個地衣樣本中分離到6株蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)，編號為BRC-ZQL1至BRC-ZQL6。
　　 為了解其生物學(xué)特性，分別對這6個菌株進(jìn)行生理生化測定，結(jié)果顯示：這些菌株在生理生化指標(biāo)上都存在著一定差異。通過cry基因PCR--RFLP檢測發(fā)現(xiàn)：6個菌株均含有cry1基因(cry1Ad、cry1Ba、cry1Cb、

2、cry1Da、cry1Ea)；5個菌株含有cry2基因(cry2Ac、cry2Ah)；這些菌株還含有cry9、cry1Ⅰ等基因。BRC--ZQL5、BRC--ZQL6菌株的PCR--RFLP圖譜出現(xiàn)特異性片段，推測其存在新基因。
　　 選用BRC--ZQL1至BRC--ZQL6和實(shí)驗(yàn)室保存的3個菌株(Bt8010、Bt HD1、Bt010)，以不同濃度菌液對廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)進(jìn)

3、行殺蟲活性初步鑒定，發(fā)現(xiàn)不同菌株毒性存在較大差異，其中BRC--ZQL3殺蟲效果最好。提取BRC--ZQL3伴孢晶體蛋白對A.cantonensis進(jìn)行生測，處理24 h和48 h的LC50分別為2.85415和1.10599 mg/mL，表明BRC--ZQL3對A.cantonensis具有較明顯的殺蟲活性。
　　 以BRC-ZQL3總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物對該菌株的cry2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物與克隆載體連接，得到

4、重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，測序可知目的基因ORF為1899 bp。將該基因序列提交NCBI(GenBank登錄號：FJ550343.1)，國際Bt命名與分類委員會將其命名為cry2Ah2基因，其為一個新基因。用生物信息學(xué)軟件分析該基因，其蛋白由632個氨基酸組成，分子量約為70.84 kDa；對該蛋白進(jìn)行了同源比對和理化性質(zhì)分析，同時預(yù)測了二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。
　　 構(gòu)建表達(dá)載體pGEX--cry2Ah2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌

5、(E.coli) BL21(DE3)，得到具有重組質(zhì)粒pGEX-cry2Ah2的BL21(DE3)，SDS-PAGE結(jié)果證明cry2Ah2基因能在該重組菌中成功表達(dá)。
　　 將重組大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，用其菌裂解液對A.cantonensis進(jìn)行毒力測定，24 h和48 h的校正死亡率分別為12.77％和22.91％，證明Cry2Ah2蛋白對A.cantonensis具有一定程度的毒性，但其殺蟲活性不高，這也表明BRC-ZQ

6、L3還存在其它的殺蟲活性因子。
　　 為提高BRC-ZQL3產(chǎn)孢水平，應(yīng)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基配方為：黃豆餅粉2％、玉米粉0.42％、酵母膏0.39％、磷酸二氫鉀0.025％、七水硫酸鎂0.035％、碳酸鈣0.04％、初始pH值為7.2。優(yōu)化后BRC-ZQL3產(chǎn)孢水平達(dá)到3.92×10-8 mL-1與響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值只有2.9％的誤差，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢水平提高了60.66％。