對(duì)華北大黑鰓金龜幼蟲(chóng)具有活性的蘇云金芽胞桿菌篩選與鑒定.pdf

1、華北大黑鰓金龜[Holotrichia oblita(Falderman)]是難以防治的地下害蟲(chóng)，給農(nóng)作物造成嚴(yán)重的損失。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種已被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治的昆蟲(chóng)病原微生物，其在芽胞形成期可產(chǎn)生主要由cry和cyt基因編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白。發(fā)掘Bt菌株資源是實(shí)現(xiàn)此類害蟲(chóng)綠色防控的重要手段，因此，為了獲得對(duì)華北大黑鰓金龜具有較高殺蟲(chóng)活性的菌株，本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的500株Bt菌

2、株材料為基礎(chǔ)，通過(guò)殺蟲(chóng)活性測(cè)定篩選對(duì)華北大黑鰓金龜幼蟲(chóng)有活性的菌株，進(jìn)一步對(duì)菌株多樣性分析、菌株晶體形態(tài)觀察和蛋白表達(dá)分析、基因鑒定和華北大黑鰓金龜幼蟲(chóng)感染Bt后中腸組織病理切片等方面進(jìn)行了一系列的研究，其主要結(jié)果如下:
　　對(duì)華北大黑鰓金龜幼蟲(chóng)有活性菌株的篩選:以實(shí)驗(yàn)室分離的500株Bt菌株為材料，通過(guò)殺蟲(chóng)活性測(cè)定篩選到了42株對(duì)華北大黑鰓金龜幼蟲(chóng)具有不同程度活性的菌株，其中有10株14天的校正死亡率大于60％，而261-1菌株

3、7天校正死亡率就達(dá)到100％，其余菌株的14天校正死亡率在30‰60％之間。
　　菌株多樣性分析:利用本實(shí)驗(yàn)室建立的便捷的Bt菌株比較鑒別技術(shù)，對(duì)這42株菌株進(jìn)行多樣性分析，以42株菌株的基因組為模板，利用優(yōu)化后的簡(jiǎn)并引物和PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，并利用Hinfl對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，通過(guò)電泳分析獲得了33個(gè)菌株的RFLP圖譜，分析比較顯示它們屬于14個(gè)不同的菌株類型，從而有效的去除了冗余菌株，結(jié)合菌株對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)臍⑾x(chóng)活性數(shù)

4、據(jù)，選擇1126-1、P65-1、QDL47-1、261-1、FTL84、78-2、127-2、78-3、1198-1、S10A2、B8E12、QDL40-2、FCD114、B8E11等14株Bt菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
　　菌株晶體形態(tài)觀察和蛋白表達(dá)分析:通過(guò)對(duì)14株Bt菌株的晶體形態(tài)電子顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，78-3、127-2和1198-1菌株能產(chǎn)生雙錐體型晶體;261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和112

5、6-1菌株能產(chǎn)生球形晶體，而其它5個(gè)菌株沒(méi)有晶體存在。通過(guò)SDS-PAGE分析了14株代表菌株表達(dá)蛋白情況，結(jié)果顯示菌株P(guān)65-1、1126-1、127-2、78-3、261-1、FCD114、1198-1和78-2能表達(dá)典型的約130 kDa的Bt Cry蛋白，QDL47-1和B8E11表達(dá)了約97 kDa蛋白，其余菌株表達(dá)了少量60 kDa的蛋白。
　　cry基因鑒定:利用cry3、cry8、cry18、cry23、cry37

6、、cry43類通用引物對(duì)14株Bt菌株進(jìn)行進(jìn)一步基因鑒定，結(jié)果顯示這14個(gè)菌株中，只有P65-1、1126-1、FCD114和78-2四個(gè)菌株分別含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea等5類cry8類新基因;而包括對(duì)華北大黑鰓金龜幼蟲(chóng)活性最高的261-1菌株在內(nèi)的其它10個(gè)菌株均不含有cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)有效的殺蟲(chóng)基因。質(zhì)譜鑒定結(jié)果也顯示了P6