造血干細(xì)胞移植術(shù)后sFractalkine與aGVHD關(guān)系的初步研究.pdf

1、背景：
　　 異基因造血干細(xì)胞移植(allo—HSCT)是治療惡性血液病的有效方法。但急性移植物抗宿主病(aGVHD)是其嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。目前,aGVHD的診斷主要依靠臨床癥狀:如皮膚出現(xiàn)皮疹、肝功損害、腹瀉等,缺少相對(duì)穩(wěn)定和可靠的血清學(xué)指標(biāo)。能否尋找一個(gè)血清學(xué)指標(biāo)應(yīng)用于臨床的早期診斷及早期預(yù)測(cè)疾病的狀態(tài)是臨床工作者追求的目標(biāo)。
　　 趨化因子(chemokines,CK)是一類能夠調(diào)控細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子,廣泛存在

2、于白細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞,并且通過與相應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合從而介導(dǎo)對(duì)白細(xì)胞的趨化作用。一種趨化因子能與多個(gè)趨化因子受體相結(jié)合,而一個(gè)趨化因子可能有多個(gè)高親和性受體,它們共同構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡。迄今為止至少已發(fā)現(xiàn)50余種趨化因子,趨化因子結(jié)構(gòu)和功能相似,據(jù)其前兩個(gè)半胱氨酸的相對(duì)位置不同,大致可分為4個(gè)亞族:C、CC、CXC和CX3C趨化因子。目前已明確的趨化因子受體

3、有20多種,它們屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,主要表達(dá)于骨髓來源的各白細(xì)胞亞群,同時(shí)也表達(dá)于上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等類型的細(xì)胞上。趨化因子首先作為趨化性介質(zhì)被發(fā)現(xiàn),但隨著對(duì)趨化因子研究的深入,現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到趨化因子不但對(duì)白細(xì)胞具有趨化作用,而且在免疫細(xì)胞和器官的發(fā)育、免疫應(yīng)答過程、炎癥反應(yīng)、病原體感染、創(chuàng)傷修復(fù)及腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮廣泛的生理和病理作用。由于其廣泛的細(xì)胞來源和生物學(xué)效應(yīng),趨化因子在多種炎性和自身免疫性疾病的發(fā)

4、生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　 Fractalkine(Fkn)又稱不規(guī)則趨化因子,是由體內(nèi)多種組織細(xì)胞分泌的具有黏附功能的趨化因子,是1997年發(fā)現(xiàn)的CX3C趨化因子家族中唯一的成員,定位于人染色體16q13,有膜結(jié)合型和可溶型兩種形式存在,各自發(fā)揮使外周血白細(xì)胞游走和粘附的作用,因此兼有趨化因子和細(xì)胞間粘附分子兩種作用。由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),當(dāng)發(fā)生炎癥時(shí)表達(dá)上調(diào)。大多數(shù)Fkn表達(dá)在活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面,參與

5、白細(xì)胞向炎癥組織的游走[1]。由于內(nèi)皮是白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)移的第一道屏障,因此內(nèi)皮細(xì)胞表面的Fkn是控制炎癥部位白細(xì)胞滲出的門戶[1]。而當(dāng)Fkn的胞外部分被蛋白酶水解,由細(xì)胞表面脫落,變成可溶性不規(guī)則趨化因子(sFkn)。sFkn趨化單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞到血管壁內(nèi)皮細(xì)胞附近,這些炎性細(xì)胞被誘導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)移,同時(shí)釋放干擾素-γ(IFN—γ)、腫瘤壞死因子α(TNF—α)、穿孔素和端粒酶等,破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞和其

6、他組織細(xì)胞,引起血管炎和器官損害。TNF—α能誘導(dǎo)Fkn的脫落,IFN—γ起協(xié)同作用,而白介素(IL)-4或IL-13能完全阻斷Fkn細(xì)胞外片段的脫落,提示這些細(xì)胞因子也參與Fkn脫落的調(diào)控過程[2]。
　　 CX3CR1是Fkn的特異性受體,主要表達(dá)在NK細(xì)胞、C08 T釧胞、CD14+單核細(xì)胞,sFkn分子表現(xiàn)出強(qiáng)有力的趨化這些細(xì)胞向上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹枝狀細(xì)胞黏附的活性[3]。Fkn與CX3CR1相互作用也能通過G蛋白轉(zhuǎn)

7、換信號(hào),提高整合素結(jié)合配體的能力。因此,整合素和其配體如ICAM—1(細(xì)胞間粘附分子-1)和VCAM-1(血符細(xì)胞粘附分子-1)與Fkn/cX3CR1系統(tǒng)共同存在時(shí),可大大提高細(xì)胞粘附作用[1,4]。到目前為止,還沒有實(shí)驗(yàn)確切證實(shí)Fkn/CX3CR1系統(tǒng)引發(fā)怎樣的細(xì)胞內(nèi)分子水平反應(yīng)。有研究表明,CX3CR1為G蛋白耦聯(lián)受體,Fkn與CX3CR1結(jié)合以后,可以通過與 G蛋白耦聯(lián),啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,促進(jìn)核因子κB(nuclear fa

8、ctorκB)和TNF—α的表達(dá),從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[5]。有學(xué)者[6]應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(空白對(duì)照)和Fkn分別誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Fkn處理組表達(dá)NF—κB的陽性細(xì)胞數(shù)以及TNF—α表達(dá)值均比對(duì)照組顯著增加。在移植免疫中Th1細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng),而Th2細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受。而TNF—α是Th1型細(xì)胞亞群產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子之一,Fkn可能通過改變Th1/Th2平衡而導(dǎo)致組織損傷,進(jìn)而發(fā)生aGVHD。
　　 aGVH

9、D是由移植物中所含供者T細(xì)胞識(shí)別宿主抗原而攻擊宿主組織器官所產(chǎn)生的病理損傷、并導(dǎo)致宿主多臟器損傷的一個(gè)疾病過程,是造血干細(xì)胞移植常見的嚴(yán)重并發(fā)癥。研究表明:IL-1、可溶性IL-2受體(sIL-2R)、TNF—α等在發(fā)生aGVHD時(shí)體內(nèi)水平明顯升高。有研究[7]報(bào)道異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)TNF-α、IL-4、TGF—α水平變化有助于對(duì)aGVHD做出診斷,且對(duì)判斷aGVHD輕重程度有一定的臨床意義。但目前總體上還是缺乏一種能夠預(yù)

10、警aGVHD發(fā)生的可靠穩(wěn)定的方法。國內(nèi)外有關(guān)Fkn的研究多集中在類風(fēng)濕病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面[8-11],關(guān)于Fkn和aGVHD的相關(guān)研究文獻(xiàn)鮮見。Robinson[12]等報(bào)道Fkn表達(dá)升高可顯著提高對(duì)移植心臟的排斥,尤其表現(xiàn)在血管內(nèi)皮系統(tǒng)損傷,而給予受者抗-CX3CR1阻斷抗體治療后,明顯延長移植物的存活時(shí)間；Satoshi Ueha[13]發(fā)現(xiàn)對(duì)黏膜血管定居因子和Fkn的干預(yù)治療在減輕腸道的移植物抗宿主反應(yīng)損傷的同時(shí)保護(hù)了移植物抗

11、腫瘤效應(yīng)。這些研究提示Fkn表達(dá)升高可能預(yù)示著aGVHD的發(fā)生。而造血干細(xì)胞移植患者經(jīng)大劑量預(yù)處理及干細(xì)胞植入并經(jīng)歷了造血重建和免疫重建過程,當(dāng)發(fā)生GVHD時(shí),TNF—α、IFN—γ、IL-4都會(huì)發(fā)生變化,與細(xì)胞趨化作用有關(guān)的sFkn在體內(nèi)有無變化,目前該方面的研究報(bào)道不多。
　　 本研究分兩部分,第一部分是建立測(cè)定sFkn的方法,為測(cè)定allo—HSCT患者移植前后血清sFkn的濃度建立方法,并測(cè)定了35例正常人血清sFkn的

12、濃度；第二部分測(cè)定20例接受HSCT的惡性血液病患者移植前和移植后不同時(shí)間的血清sFkn的濃度。以正常人血清sFkn濃度為對(duì)照,探討sFkn與aGVHD兩者之間的關(guān)系。
　　 目的：
　　 建立sFkn的測(cè)定方法,測(cè)定正常人血清sFkn的濃度；觀察造血干細(xì)胞移植(HSCT)患者體內(nèi)sFkn的變化,探討sFkn與急性移植物抗宿主病(aGVHD)的關(guān)系。
　　 方法：
　　 第一部分:建立競(jìng)爭抑制ELISA法

13、測(cè)定sFkn,繪制出sFkn的標(biāo)準(zhǔn)曲線；在此基礎(chǔ)上測(cè)定正常人血清sFkn的濃度。
　　 1.sFkn測(cè)定的具體操作步驟:
　　 1).在操作前準(zhǔn)備所有的物品,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的移取均使用微量移液管。取出試驗(yàn)用品,于室溫(20-25℃)放置15—30分鐘。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在室溫(20—25℃)內(nèi)進(jìn)行；
　　 2).取出酶標(biāo)板,按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔?？瞻孜⒖字屑尤?00μl的樣品,空白對(duì)照加

14、入100μl的蒸餾水；
　　 3).在各孔中加入50μl的酶標(biāo)記溶液；(不含空白對(duì)照孔)。將酶標(biāo)板用封口膠密封后,37℃孵育反應(yīng)1小時(shí)；(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)；
　　 4).洗板.濃縮洗滌液以1:100的比例與蒸餾水稀釋,充分清洗酶標(biāo)板3-5次,保持各孔有充足的水壓；酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干；
　　 5).各孔加入顯色劑A、B液各50μl；(不含空白對(duì)照孔)。20-25℃下避光反應(yīng)15分鐘；

15、>　　 6).各孔加入50μl終止液,終止反應(yīng);
　　 7).30分鐘內(nèi)在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；
　　 8).將OD值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行曲線擬合,建立方程。由電腦自動(dòng)計(jì)算得出結(jié)果。
　　 第二部分:用上述建立的競(jìng)爭抑制ELISA法定量檢測(cè)20例接受HSCT的惡性血液病患者移植前和移植后不同時(shí)間的血清sFkn的濃度,以35例正常人血清sFkn的濃度為對(duì)照,分析白血病患者移植前后不同時(shí)間血清sFk

16、n的濃度變化及與aGVHD的關(guān)系。sFkn抗體等由上海藍(lán)基生物科技有限公司所提供。全部病人和正常人清晨空腹靜脈采血,采集后立即離心(1000r/min,5min)分離,取上清-20℃保存待測(cè)。
　　 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05則差異具有顯著性意義。
　　 結(jié)果：<

17、br>　　 1.成功建立了sFractalkine的測(cè)定方法,建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,在0.5～5 ng/ml之間有良好的的劑量效應(yīng)關(guān)系。批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為14.4％和9.43％。
　　 2.正常人血清sFkn的濃度在為3.9325±0.8027ng/ml。
　　 3.HSCT患者移植前血清sFkn的濃度為4.2806±1.4044ng/ml。其中4例自體HSCT(auto-HSCT)患者移植后15天血清sFkn的濃度為

18、3.6800±1.5451ng/ml；10例異基因HSCT(allo-HSCT)后未發(fā)生急性GVHD患者移植后15d血清sFkn的濃度為3.6240±0.9980ng/ml；6例allo—HSCT后發(fā)生急性GVHD患者移植后15d血清sFkn的濃度為5.7752±0.6618ng/ml。全部患者移植前,auto—HSCT患者、allo—HSCT后未發(fā)生aGVHD的患者,血清sFkn的濃度和正常人比較變化不明顯(P>0.05)；發(fā)生aGV